생명과학실험 | 단백질 분리정제 및 기능분석

 

 

 

TIP

 

 

1. DEAE Sepharoge anion exchange chromatography를 통한 단백질 분리
2. Column chromatography를 이용하여 Alkaline phosphatase를 분리한다.

 

 

 

AP의 정제과정

1. AP가 outer membrane과 inner membrane 사이에 존재하는 경우, osmotic shock을 주어 outer membrane만 깨지게 한다.

 

2. Spheroplast 상태일때 centrifuge를 하면 supernatant와 pelet으로 분리된다. (이때, AP는 sup. 에 존재한다)

 

3. AP의 크기를 이용하여 dialysis를 하여 size 별로 분리한다. Bovine의 경우는 homodimer상태로 kDa=160-180 이다.

 

4. Bovine의 AP가 75-85℃에서도 stable한 특성을 이용하여 전단계에서 분리한 것에 Heat shock을 준다. 대다수는 열에서 inactivation 되지만, Bovine의 AP는 active 된다.

 

5. Bovine의 AP가 negative charge를 띠는 것을 이용하여 column chromatography를 사용하면 AP만을 얻을수 있게된다.

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실험 방법

1. 실험 과정

1) 각 faction을 받을 10개의 e-tube(microtube)를 준비한다.

 

2) 각 tube labelling을 하고, 500㎖ 지점을 표시한다. 즉, 6개의 15㎕ tube각각에 wash buffer, 50mM NaCl buffer, 75mM NaCl buffer, 125mM NaCl buffer, 200mM NaCl buffer를 각각 넣고, 나머지 하나에는 FT라고 labeling 해 놓는다.

 

3) 원액 enzyme solution을 조금 덜어 놓는다. (sample①)

 

4) 스탠드에 column을 장치하고 bead 300㎕를 loading한다. Slurry는 bead와 buffer의 1:1 혼합물이므로 총 600㎕를 loading한다. 즉, buffer용액과 1:1 비율로 섞인 slurry 상태의 bead를 column에 넣어준다.

 

5) 층이 분리되고 나면 column의 마개를 열어주고 buffer 용액이 흘러나오도록 한다.(bead가 마르면 charge를 띄는 부분이 제대로 기능을 하지 못하기 때문에 바로 다음 단계로 넘어가도록 한다.)

 

6) Tris- HCl buffer를 사용하여 bead washing을 해준다. (10배의 양(5㎖)으로 5회 나누어 bead의 위아래가 뒤집어질 정도로 세게 해 주어야 한다.)

 

7) bead packing 하기 : 크로마토그래피의 특성상 고정상의 길이가 일정해야 보다 확실하게 분리하고자하는 물질을 분리해 낼 수 있다. 따라서 wash buffer가 흘러나오고 그것을 실험이 끝날 때까지 유지해야 한다)

 

8) DEAE column에 protein solution을 loading 한다. : Flow Through (sample②)

 

9) Column의 뚜껑을 꺾어 따고 어느 정도 slurry의 buffer를 흘려보낸다. 즉, Elution 하기 전에 bead washing을 통해 nonspecific bound protein을 제거한다. (1㎖씩 3번 washing해준다.)

 

10) Bead에 ethanol이나 먼지와 같은 불순물이 섞여있을 수 있기 때문에 1M Tris-HCl buffer를 이용해 washing해준다. Washing하는 buffer의 양은 bead의 10배, 즉, 3㎖를 사용한다. Washing을 할 때에는 bead의 표면이 마르지 않도록 주의하고, bead가 뒤집힐 수 있도록 pipette을 이용해 buffer를 강하게 넣어준다.

 

11) Buffer를 bead의 표면이 마르지 않을 정도로 내려보내며 bead를 packing한다. Bead가 흐트러지지 않도록 주의한다.

 

12) Protein mixture 300㎕를 따서 e-tube에 넣은 다음, labeling을 하고 ice box에 넣는다. (Ⅰ)

 

13) Column의 아래에 FT라고 표기해 놓은 15㎖ tube를 두고 protein mixture 3㎖ (10mg/㎖)를 column을 따라 둥글리며 넣어준다. 세게 넣으면 bead가 패일 수 있으므로 조심스럽게 넣어준다. (Ⅱ)

 

14) Bead의 2배에 해당하는 양인 elution buffer 600㎕를 농도가 낮은 순서부터 넣고, 300㎕씩 e-tube에 내린 다음 labeling을 하고 ice box에 넣는다.

50mM NaCl (Ⅲ) (Ⅳ)

75mM NaCl (Ⅴ) (Ⅵ)

125mM NaCl (Ⅶ) (Ⅷ)

200mM NaCl (Ⅸ) (Ⅹ)

Elution buffer는 낮은 농도부터 packing된 bead가 흐트러지지 않도록 column둘레를 둥글리며 서서히 넣어준다.

 

15) protein을 elution하기 : NaCl solution 50mM, 75mM, 125mM, 200mM 순으로 1㎖씩 넣어줄 것인데, sample 용액 채집방법은 그 반씩 (0.5㎖) 나누어 용출 시킬 것이다. (sample ③～⑩) 일단 농도를 달리 하는 것은 결합세기에 차등을 두는것이고 그것을 더 세분화 하는 것은 속도요인 까지 고려한 것이다. 즉 똑같은 NaCl 농도라도, 빨리 용출되는 것은 나중에 용출되는 것들 보다 약한 binding을 이루고 있는 것이다.

 

16) 분리한 (Ⅰ)～(Ⅹ) fraction을 –70℃ 냉동고에 보관하여 Alkaline phosphatase의 purity와 activity 실험을 준비해 둔다.

 

17) 또한, SDS-PAGE와 Western Blot, Enzyme activity assay등의 실험을 위해 분리한 각 fraction을 –70℃ 냉동고에 보관한다.

 

18) Bead는 재활용이 가능하므로 8)번까지의 과정이 완료된 후에는 1～2M의 고농도 NaCl buffer를 떨어뜨려 주어 bead에 남아있는 protein을 제거한다.

 

19) regeneration 하기 위해서는 1～2M 정도의 NaCl 용액을 bead에 통과시키고 더 오래 보관(storage) 하기 위해서는 20% ethanol 용액을 bead와 1:1로 섞어 slurry 상태로 만든 다음에 4℃에서 보관한다.

 

 

 

단백질 분리정제 및 기능분석 레포트