식품미생물학실험 | 미생물 배양 실험

 

 

 

TIP

 

 

1. 배지 조제 및 배양
2. 토양세균 분리 및 배양(bacillus)
3. 현미경 검경
4. 유산균 배양 후 총균수 측정
5. 대장균 배양
6. 곰팡이 배양
7. Gram 염색

 

 

 

배지 조제 및 배양

1. Na배지 만들기

1) 삼각 플라스크에 2.3g의 nutrient agar를 넣어 증류수로 100㎖ 맞춰 희석 시켜준다.

 

2) 희석 시킨 후 고무마개로 막고 호일로 마개를 감싸 준 후 auto clave에 넣어 121℃ 15분간 고압 증기멸균을 시킨다.

 

3) 살균이 된 na 배지를 clean bench에 가져가 petri dish에 적정량을 넣어 뚜겅을 열어둔 상태에 서 통풍장치를 통해 식히며 굳히면 평판 배지가 된다.

 

2. 사면 배지 만드는 법

1) na를 증류수로 희석 시킨 다음 test tube에 1/3정도 넣어(45` 기울였을 때 뚜겅에 닿지 않게해야 된다. 닿으면 오염) 뚜겅을 닫아준다.

 

2) test tube rack에다가 꽂아 준 후 호일로 감싸주고 auto clave에 넣어 121℃ 15분간 고압증기멸 균을 시킨다.

 

3) 살균이 다 끝났으면 45`로 기울여 눕혀 굳힌다.

 

3. bacillus배양(streak plate method)

1) 만들고 나서 냉장고에 보관 했던 na평판 배지를 clean bench로 가지고 온다.

 

2) clean bench 사용 전 70% alcohol로 손을 소둑 시켜 주고 나서 사용 한다.

 

3) alcohol 램프를 킨 후 백금이를 화염 멸균 시켜 준 후 불 근처에서 제시된 bacillus가 있는 test tube의 실리콘마개를 백금이를 들고 있는 손의 새끼 손가락과 약지를 이용해 열고 test tube 입구를 화염멸균 시킨 후 백금이로 따낸다.

 

4) 고무마개랑 test tube 입구를 화염 멸균 시켜 준 후 닫아 주고 na평판 배지를 열어 bacillus를 따낸 백금이로 streaking을 해준다.

 

5) streaking 할 때는 가장 자리에 1획씩 그어 주면서 돌려가면서 5획 정도 한다.

 

6) 그 후 incubator에 넣어 관찰 한다.

 

 

토양세균 분리 및 배양(bacillus)

1. 토양 세균 분리

1) 밖에서 토양을 채취하고 palcon tube에 약간 넣고 증루수로 희석하여 vortexing하고 중탕시켜준다.

 

2) clean bench안에서 화염멸균 시킨 백금이를 이용해 중탕시킨 희석시킨 흙탕물을 따서 PCA평판배지에 streaking 해준다.

 

3) incubator에 넣어 관찰한다.

 

2. 토양 세균과 Scb-2(bacillus)배양(평판배지)

1) clean bench에 원형 colony가 생성된 토양 세균과 교수님이 제시 해준 bacillus균 scb-2를(사면 배지) alcohol소독 후 가져간다.

 

2) 화염멸균 시킨 백금이를 이용해 petri dish에 있는 토양 colony를 따내고 pca배지에 streaking을 해준다.

 

3) 백금이를 화염멸균 시켜 준 후 scb-2의 test tube를 열어 test tube입구를 화염멸균 시켜 준 후 scb-2를 따낸다.

 

4) test tube의 입구와 실리콘 마개를 화염멸균 시키고 봉하고 따낸 scb-2를 PCA평판배지에 streaking 을 해준다.

 

5) incubator에 넣어 관찰한다.

 

3. scb-2 사면배지 배양

1) clean bench에서 교수님이 제시 해준 scb-2를 화염멸균 시켜준 백금이로 따낸다.

 

2) 사면배지가 있는 test tube를 열어 입구를 화염멸균 시켜준 후 사면의 아래서부터 위쪽으로 지그재그 모 양으로 올리면서 획선 접종을 하고 다시 test tube 입구와 면전을 화염 멸균 시켜주고 봉해준다.

 

3) incubator에 넣어 관찰한다.

 

 

현미경 검경

1. 실험 과정

1) clean bench 안에서 토양세균을 배양했던 평판 배지에 있는 colony 부분에서 화염멸균 한 백금이로 따낸다.

 

2) slide glass에서 묻혀 준 후 증류수 한방울을 스포이드로 떨어 뜨려주고 cover glass를 45˚정도 기울여 덮어준다.

 

3) 덮어주고 나서 cover glass 옆으로 세어 나온 증류수를 휴지로 닦아준다.

 

4) 먼저 현미경의 광원을 킨 후 재물대에 올려 고정 시켜주고 대물렌즈는 40배로 맞춘다.(접안렌즈는 10배)

 

5) 재물대 위에 있는 slide glass를 조절 나사로 위치를 조정해주고 조동나사로 대물렌즈와 근접하게 한다.

 

6) 접안렌즈를 통해 관찰 하면서 미동나사로 뚜렷한 균 모양을 찾는다.

 

2. 사면배지에서 따내서 관찰 하기

clean bench에서 면전을 연 후 test tube입구를 화염멸균 시켜주고 깊숙이 넣지 말고 그냥 사면배지 상단 부분에서 화염멸균한 백금이로 따내고 위 과정과 동일하게 한다.

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유산균 배양 후 총균수 측정

1. 생리 식염수 만들기

1) NaCl 0.85g을 칭량하여 증류수 100㎖와 함께 섞어서 희석해 준다.

 

2) 제조한 식염수를 test tube 8개에 각각 9㎖씩 넣고 호일로 감싸 준 후 auto clave에 넣어 121℃에서 15분간 멸균한다.

 

2. BCP(Bromo Cresol Purple)배지 만들기

1) BCP 2.366g을 칭량하고 증류수로 100㎖ 맞춰 희석 시켜준 후 tween 80을 넣어 준다.

 

2) 제조한 배지를 flask에 넣고 실리콘마개로 막은 다음 호일로 감싸 주고 auto clave에 넣고 121℃ 15분간 멸균한다.

 

3. 희석하기

1) 준비된 생리 식염수를 clean bench에 가져온다.

 

2) 시중에 파는 유산균 음료(불가리스)를 멸균한 마이크로 피펫팁을 끼우고 마이크로 피펫으로 1㎖칭량하여 9㎖ 생리 식염수가 있는 test tube에 넣어 vortexing 해줘서 10배 희석 시켜준다.

 

3) 썻던 마이크로 피펫팁을 버리고 새로운 마이크로 피펫팁을 끼운 다음 10배 희석 한 불가리스에서 1㎖ 칭량하여 9㎖ 생리 식염수가 있는 test tube에 넣어 vortexing 해줘서 10²배 희석 시켜준다.

 

4) 이런 식으로 반복하여 10⁷까지 희석 시켜준다.

 

4. 배지 만들기

1) clean bench 안에서 10⁵, 10⁶, 10⁷에서 각각 1㎖ 씩 2번 칭량하여 petri dish에다가 넣고 BCP배지를 각각 넣어 줘서 섞이게 조심히 흔들어 줘서 총 두 개씩 6개를 만들어 준다.

 

2) incubator에 넣어 관찰한다.

 

5. 고층배지에다가 배양

1) bcp를 증류수와 섞어준 다음 test tube에 넣어 auto clave에 넣어 121℃ 15분간 돌린 후 식혀 세워서 굳혀준다.

 

2) auto clave 안에서 화염 멸균시킨 백금선으로 위에서 자란 우산균 배지에서 채취하고 고층 배지 의 중앙부 밑으로 직선이 되도록 접종한다.

 

3) 백금선이 아래 거의 바닥까지 꽂아 줬다가 조심히 다시 곧바로 위로 뺀다

 

4) test tube입구를 화염멸균 시킨 후 다시 실리콘 마개로 막는다.

 

5) incubator에다가 배양한다.

 

 

 

대장균 배양

1. 배지 만들기

1) EMB배지를 5.394g을 넣어 증류수로 150㎖로 맞춘 후 auto clave에 121℃에 15분간 멸균 시킨다.

 

2) clean bench에서 petri dish에다가 넣어 식히며 굳혀 준다.

 

2. Spread plate 하기

1) clean bench 안에서 굳힌 EMB배지에다가 화장실 물을 스포이드로 2～3방울 떨어 뜨린다.

 

2) 콘라주 봉을 먼저 alcohol로 1차 소독 시켜 주고 나서 두 번째로 화염 멸균 시켜주고 냉각 시킨 후 EMB 배지 위에 떨어 뜨린 화장실 물을 뻑뻑 할 때 까지 밀어 준다.

 

3) incubator에 보관하고 관찰 한다.

 

3. 대장균 분리 후 배양

1) clean bench에서 incubator에서 자란 대장균을 화염멸균 한 백금이로 따낸다.

 

2) EMB배지에다가 streaking을 해주는데 한 획 그어주고 화염멸균 시키고 다시 따내서 한획 그어주고 이 런 과정을 반복하여 한다.

 

3) incubator에 넣어 관찰 한다.

 

 

곰팡이 배양

1. 배지 만들기

1) PDA를 2.35g을 100㎖에 증류수로 맞춰 주고 희석 시켜준 후 절반은 실리콘 마개로 막고 호일로 입구를 감 싸 준다.

 

2) 나머지 PDA는 test tube 1/3정도 넣어 호일로 감싸준다.

 

3) Czapek가루는 액체배지용이라 고체배지로 하기위해 agar를 넣어서 증루수와 섞어 실리콘 마개로 막아 호일로 입구를 감싸준다.

 

4) 희석 시킨 PDA와 Czapek을 auto clave에 121℃에 15분간 멸균 시켜준다.

 

5) 멸균이 다 된 PDA와 Czapek을 clean bench에 가지고 간 후 petri dish에 각각 적정량을 넣어줘서 평판 배지를 만들어 식히며 굳혀 준다.

 

6) test tube에 넣었던 PDA는 45˚기울여 놔 굳혀 사면배지를 만든다.

 

2. 곰팡이 배양(평판 배지)

1) 제시된 곰팡이 cjcm-4, cjcm-5를 clean bench로 가지고 간다.

 

2) 곰팡이 배양 할 때 는 곰팡이가 날라 갈 수 가 있어 clean bench의 통풍 장치를 꺼둔다.

 

3) 작업은 alcohol램프에 불 근처에서 작업 하며 백금구를 먼저 화염 멸균 시켜준다.

 

4) cjcm-4가 있는 사면배지의 실리콘 마개를 열고 test tube입구를 화염 멸균 시켜 준 다음 백금구로 따 낸다.

 

5) 그러고 나서 test tube 입구와 실리콘 마개를 화염멸균 시키고 뚜겅을 닫아 주고 PDA배지를 거꾸로 든 상태에서 가운데부분에 조심스럽게 cjcm-4를 따낸 백금구를 찍어준다.

 

6) 이런 방법으로 czapek배지에다가도 배양을 해주고 cjcm-5도 PDA배지와 Czapek배지에 배양을 해준 다.

 

7) incubator에 넣어 관찰 한다.

 

3. 곰팡이 배양(사면 배지)

1) clean bench 안에서 cjcm-4가 있는 사면배지의 실리콘 마개를 열어 준 후 입구를 화염 멸균 시켜주고 백금이로 따낸다.

 

2) PDA 사면배지가 있는 실리콘 마개를 열어 준 후 test tube입구를 화염멸균 시켜준다.

 

3) 그 후 백금이를 사면의 streaking 하고 다시 test tube 입구와 실리콘 마개를 화염멸균 시켜주고 봉해 준다.

 

4) 위의 방법대로 cjcm-5도 배양 시켜준다.

 

5) incubator에 넣어 관찰 한다.

 

4. 검경하기

1) clean bench 안에서 화염멸균 시킨 백금이로 곰팡이를 따 낸 후 slide glass에서 묻혀 준 후 증류수 한방울을 스포이드로 떨어 뜨려주고 cover glass를 45˚정도 기울여 덮어준다.

 

2) cover glass에 세어 나온 증류수를 휴지로 흡수해서 없애준다.

 

3) 현미경으로 검경 한다.

 

 

Gram 염색

1. 실험 과정

1) slide glass 위에 gram 염색 할 유산균 화염멸균한 백금이로 따내서 묻혀 준후 도말, 건조, 고정시킨다.

 

2) Crystal violet를 도말 표본 위에 스포이드로 가하여 1분간 염색한다.

 

3) slide glass를 뒤지은 후 약하게 흐르는 수돗물에 뒷면으로 수세해주고 Gram`s iodine solution으로 1분간 매염한다.

 

4) 뒤집어서 수세 해준 후 50% acetone alcohol로 10`20초간 탈색시켜준다. (이때 오래하면 Gram 양성균 이 탈색 되어 Gram 음성으로 보이기도 한다.)

 

5) 뒤집어서 수세 후 safranin O solution으로 30초간 대조 염색을 해준다.

 

6) 뒤집어서 수세 후 남은 수분을 휴지로 흡수시킨 후 건조 시키고 immersion oil lens로 검경을 한다.

 

 

 

 

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