세포생물학실험 | Extraction of genomic DNA

 

 

 

Plasmid의 특징

Plasmid는 박테리아 세포 내에 독립적으로 존재하는 환형의 DNA 분자이다. 이들은 대부분 하나 이상의 유전자를 가지고 있으며, 이들 유전자는 종종 숙주세균에 의해 보여지는 유용한 특징을 담당하고 있다. 예를들어 항생제의 정상적인 독성농도에서 생존하는 능력은 항생제 저항성 유전자를 가진 plasmid가 세균 내에 존재하기 때문이다. 실험실에서 이러한 항생제 저항성은 종종 선별표지(Selection marker)로 이용된다.

 

모든 plasmid는 복제 개시점(origin of replication)이 될 수 있는 최소한 한 개의 DNA 염기서열을 갖고 있어서 세포 내에서 세균의 염색체와는 독립적으로 복제할 수 있다. 어떤 plasmid는 세균의 염색체 속으로 자신을 삽입시켜 복제한다. 이러한 plasmid (episome)들은 수많은 세포분열 동안 그 염색체 속에서 그 형태기 안정적으로 다음 세대로 유전된다. Plasmid의 크기는 1kb～250kb 이상까지 다양하다. 복제개수(copy number)란 하나의 세균세포 내에 존재하는 각각의 plasmid의 갯수이다(1개～500개 이상). 좋은 클로닝 운반체가 될려면 복제개수가 많은 것이 좋다.

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실험 방법

1. 실험 과정

1) -70℃에서 급속 냉각한 식물체의 잎을 homogenize (균질화)한다.

 

2) 65℃ pre-warmed extraction buffer를 700㎕ 첨가

 

3) RNase A(100㎎/㎖) 7㎕ 첨가

 

4) 65℃, 5min incubation

 

5) Chloroform 570㎕ 첨가

 

6) 12000rpm 10min centrifuge

 

7) 상층액을 fresh tube로 옮김

 

8) isopropanol을 상층액 volume의 0.7배 첨가

 

9) 12000rpm 5min centrifuge

 

10) 상층액 제거

 

11) 70%EtOH 1㎖ 첨가

 

12) 12000rpm 5min centrifuge

 

13) 상층액 제거

 

14) pellet dry

 

15) 멸균 증류수 20㎕에 녹임

 

16) 42℃ 15min incubation

 

17) 4℃에 보관

 

 

 

[세포생물학실험]Extraction of genomic DNA 레포트