일반생물학실험 | 전기영동을 이용한 플라스미드의 결정

 

 

 

TIP

 

 

전기영동을 이용하여 각 시료를 분석하고 제한 효소로 처리된 플라스미드 벡터의 크기를 이용하여 플라스미드의 종류를 알아내는 것이다.

 

 

 

서론

전기영동은 주로 생체 고분자들의 성질을 연구하고, 그것들을 분석, 분리, 정제하는 중요한 방법 중의 하나이다. 전기영동은 DNA, RNA나 단백질 같은 것들이 고유의 전하를 띠고 있고, 그것들이 어떤 전기장에 놓이게 되면 이동할 수 있다는 사실을 기본으로 하고 있다. 이러한 물질들의 이동 정도는 각 물질의 크기나 모양 그리고 전하에 따라 달라진다. 즉, 크기가 큰 물질은 크기가 작은 물질보다 더 천천히 겔을 통과하기 때문에 크기에 따라 물질들이 분리된다.

 

본 실험에서 사용한 아가로오스는 해상도는 낮지만 아주 넓은 범위(200bp-50kb)의 DNA나 RNA 시료를 분리할 수 있다는 장점이 있다. 겔이 굳는 동안 아가로오스는 지지체(matrix) 형태가 되며, 그 밀도는 아가로오스의 농도에 따라 정해진다. DNA는 아가로오스의 공간을 따라 이동하게 된다. 이러한 겔에 전기장이 주어지면, 음전하를 띠는 DNA는 양극으로 이동한다. 이때 DNA가 이동하는 정도는 여러 가지 요인의 영향을 받는다.

 

아가로오스 겔에서 DNA의 이동에 영향을 주는 요인에는 DNA 크기, 아가로오스 농도, DNA 형태, 전압, 완충용액의 조성 등이다. 일반적으로 DNA 크기와 전기장에서의 이동성의 관계는 로그함수로 반비례 한다. 큰 분자는 작은 분자 보다 더 천천히 움직인다. 왜냐하면 큰 분자는 작은 분자 보다 겔의 구멍(pore)을 지나기가 어렵기 때문이다. DNA 단편은 아가로오스의 농도에 따라 각각 다른 속도로 움직인다. 이것이 아가로오스 겔이 넓은 범위의 DNA를 분리할 수 있게 해주는 중요한 요인이다

 

 

SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)

SDS-PAGE는 중성 pH에서 SDS와 2-mercaptoethanol이 전제하는 조건에서 수행된다. SDS는 단 백질과 결합하여 단백질의 규칙적인 3차 구조를 파괴하여 불규칙하고 무작정한 코일구조를 가지게 한 다. 만일 단백질이 소중합체일 경우에는 구성 단위체들로 해리시킨 후 불규칙한 코일구조를 가지게 한다. SDS와 단백질과의 이러한 작용은 단백질의 사슬 내에 있는 이황화물 다리결합 또는 사슬들 사 이의 이황화물 다리결합을 환원시키는 2-mercaptoethanol에 의하여 촉진된다.

 

SDS가 단백질과 결합 하여 단백질 복합체가 되면 단백질이 지니는 음전하는 SDS가 가진 음이온에 기인되는 것이 대부분이 다. 중성 pH에서는 단백질 자체의 전하가 극소화되기 때문에 이 경우에는 단백질이 띠게 되는 음전하 는 단백질에 결합한 SDS에서 오는 음전하뿐이다. 종류가 다른 모든 단백질에 대하여 SDS는 단위 무 게 당 일정한 양(1.4g SDS/ g 단백질)이 결합하므로 SDS-단백질 복합체는 질량에 대한 전하의 비가 일정하게 된다. 또한 SDS-단백질 복합체는 모두 불규칙한 코일구조를 가지게 있으므로 마찰계수도 동일하다. 그러므로 SDS-단백질 복합체의 전기이동 속도는 겔의 체 효과에 의해서만 좌우되며, SDS-단백질 복합체의 크기가 클수록 확산계수가 작아서 이동속도가 작아지게 된다.

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실험 방법

1. 실험 과정

1) 실험을 하기 위해서는 플라스미드가 이동하는 공간인 겔이 필요하다. 겔은 250mL 삼각 플라스크에 아가로오스 0.6g와 TAE 완충액 50mL를 넣고 섞은 다음 아가로오스가 완전히 용액 안에 녹을 때까지 전자레인지를 이용하여 가열한다.

 

2) 아가로오스가 모두 녹으면 65℃까지 식힌 다음 콤이 끼워져 있는 겔 형성 장치에 용액을 천천히 붓는다.

 

3) 겔이 다 굳으면 겔이 손상되지 않도록 콤을 조심스럽게 드러낸 다음 전기영동 장치 안에 겔을 설치하고 겔을 약간 덮을 정도로 TAE 완충 용액을 채운다.

 

4) DNA시료 1, 1을 처리한 시료, 2, 2를 처리한 시료와 대조군 DNA시료(마커)를 튜브에 각각 25μL씩 마이크로피펫에 넣고 로딩시약을 각 튜브에 5μL만큼 넣는다.

 

 

5) 제조된 용액을 앞에서 만들어 둔 웰에 각각 주입한다.

 

6) 전기영동 장치의 덮개를 덮은 후에 직류전원장치를 연결하고 100V의 전압을 걸어 주어서 전기영동을 시킨다.

 

7) 이 때 로딩 염료가 아가로오스 겔을 충분히(3/4 정도) 이동하면 전기영동을 끝내고 염색 그릇으로 옮긴다.

 

8) 염색 그릇에 메틸렌블루 용액을 넣은 후에 그 안에 겔을 넣고 쉐이커를 실온에서 1～4시간 동안 작동시킨다.

 

9) 그 후, 겔에 DNA 줄무늬가 선명하게 관찰되면 겔을 조심스럽게 흰 종이 위에 올려놓고 DNA줄무늬의 사진을 찍고 관찰한다.

 

 

 

[일반생물학실험]전기영동을 이용한 플라스미드의 결정 레포트