발생공학실험 | Tunicamycin의 첨가 배양이 돼지 미성숙 난포란의 배발달에 미치는 영향

 

 

 

실험 요약

본 실험은 Tunicamycin 의 ER stress효과를 확인 하기 위해 실시된 실험으로서, 미성숙 난포란을 채취하여 IVM-media를 기본 배양액으로 하여 체외 수정후 체외 수정된 난포란을 체외 배양하여 두 개의 비교군을 두어서 하나의 비교균은 기본 배양액을 사용하고 또 하나의 비교군은 Tunicamycin을 첨가 하여 체외 수정후 6일째와 7일째에 배반포 발달률을 조사 하였다. 실험 결과 Tunicamycin을 첨가한 실험군의 배반포 발달률이 떨어 지는 것으로 확인되었다. 이 결과를 보아 Tunicamycin이 수정란에 stress를 유발시켜 배반포 발달률을 저해하는 작용을 한다는 것을 알 수 있었다.

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실험 방법

1. 미성숙 난포란의 채취

1) 난포란의 채취를 위한 난소는 도축 직후의 미 경산돈(체중 120 ㎏내외)으로부터 적출하여 38℃의 멸균생리식염수가 충만된 보온병에 침지하여 실험실로 운반하였다.

 

2) 그리고 재차 신선 멸균생리식염수로 2～3회 세척한 다음, 100 ㎖ 비이커에 담아 38℃ 로 조정되어 있는 온수조에 넣어 실험에 공시하였다.

 

3) 미성숙 난포란의 채란은 18-gauge 주사침이 장착된 10 ㎖ 주사기로 직경이 2～5 ㎜의 포상난포로 부터 난포액과 함께 난포란을 흡인하여 Falcon tube에 옮긴 후 30℃로 조정된 Water bath에 10분간 정치, 난포란의 침전을 유도한 다음, 상층액을 버리고 pellet만을 취하여 1.5 ㎝ 간격으로 방안을 표시한 87×15㎜ 페트리접시에 넣고 0.1% TL-Hepes와 희석하여 실체현미경하에서 난구세포가 2～3층 이상 치밀하게 붙어 있고 세포질이 균일한 난포란만을 선별 및 회수하여 체외성숙 실험에 사용하였다.

 

2. 난포란의 체외성숙

1) 체외성숙용 배양액은 IVM1-media 로 North Carolina State University(NCSU)-23을 기본 배양액으로 하여 돼지 난포액 10%, Pregnant Mare's Serum Gonadotropin (PMSG) 10㎕/㎖, Human Chorionic Gonadotropin (HCG) 10㎕/㎖, Pocine Follicular Fluid (PFF) 100㎕/㎖, Cystein 10㎕/㎖, β-mercaptothanol 1㎕/㎖, Epidermal Growth Factor (EGF) 1㎕/㎖를 첨가하여사용하였다.

 

2) IVM2-media는 IVM1-media에서 PMSG와 HCG를 제외하여 만들었고, IVM1, 2-media는 0.22㎛ filter에서 filtering 하였다.

 

3) 회수한 양질의 미성숙난자는 TL-HEPES 배양액으로 2회 세정하고, 곧바로 체외성숙용 배양액으로 2회 세정하였다.

 

4) 세정된 미성숙 난자는 각 well당 40～50개씩 넣어 39℃, 5％ CO2, 포화습도 조건의 배양기 내에서 호르몬이 첨가된 배양액에서 22시간, 호르몬이 첨가되지 않은 체외성숙용 배양액에서 22시간, 총 44시간 동안 배양하여 체외성숙을 유도하였다.

 

3. 체외수정을 위한 난포란의 준비

1) 체외수정용 배양액은 modified Tris-buff ered medium(mTBM)을 기본 배양액으로 0.042% caffeine(Sigma, USA)과 0.1％ BSA(A7888, Sigma, USA)가 함유된 mTBM용액을 사용하였고, 정액의 세정액으로는 Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline(DPBS; Gibco, Life Technologies Inc., Grand Island, NY, USA)에 0.1％ BSA가 첨가된 배양액을 사용하였다.

 

2) 44시간 동안 체외성숙된 돼지 난포란은 0.1％ hyaluronidase(Sigma, USA)가 함유된 NCSU-23 용액에 넣어 연속적인 피펫팅으로 난구세포를 제거하고, 0.042% caffeine과 0.1％ BSA가 함유된 mTBM 용액으로 3회 세정하였다.

 

3) 세정 후 미리 48시간 전배양을 실시한 48㎕ drop을 찍어놓은 수정용 배양액에 drop 당 15개의 성숙난자를 넣고 매정시까지 배양기 내에서 배양하였다.

 

4. 체외수정

1) 정액은 인공수정용 액상정액으로 사용 직전까지 17℃ 항온고에서 최대 4일간 보존하면서 사용하였다.

 

2) 보존된 정액은 사용직전에 정액세정액(DPBS)과 함께 1 : 1 비율로 15 ㎖ falcon tube에 넣고 450g에서 3분간 원심분리를 실시하여 상층액을 제거하는 세정과정을 3회 실시하였다.

 

3) 마지막으로 하단에 남은 정자 침전물에 정자 세정용배양액을 넣어 39℃, 5％ CO2 및 포화습도의 CO2배양기 내에서 10분간 정치하였다.

 

4) 운동성을 가진 부유된 정자들을 회수하여 450g에서 3분간 원심분리를 실시한 다음, 침전된 정자를 체외 수정용 배양액으로 재차 희석하였다.

 

5) 희석된 정자는 성숙난자가 들어 있는 drop에 각각 2 ㎕씩 주입한 후 39℃, 5％ CO2 및 포화습도의 CO2배양기 내에서 5～6시간 동안 체외 수정을 실시하였다.

 

5. 수정후 체외배양

1) 돼지 체외수정란의 배양은 0.3% BSA (A0281, Sigma)가 함유된 Porcine Zygote Medium(PZM)을 기본배양액(Control)으로 사용하였고, Tunicamycin을 2㎍/㎖ 첨가한 TM-media을 사용하였다.

 

2) 체외수정이 완료된 수정란은 pipetting 및 IVC media로 3회 세척하여 잔류된 난구세포와 투명대부착정자를 제거한 후, 각각의 첨가군별로 50㎕ 씩 dish에 drop하여 drop 당 30개의 oocyte를 배양하고, 39℃, 5％ CO2 및 포화습도의 탄산가스배양기 내에서 각각 배양하여 체외배발달을 유도하였다.

 

3) 체외배양 2일째에 난할률을 조사하였고, 6일 및 7일째 배반포 발달률을 조사하였다.

 

 

 

 

[발생공학실험]Tunicamycin의 첨가 배양이 돼지 미성숙 난포란의 배발달에 미치는 영향 레포트