화공생물공학실험 | DNA 제한효소

 

 

 

TIP

 

 

Lambda DNA를 임의의 제한효소로 절단하고, 이를 전기영동을 하여 사용된 제한효소의 기작 및 DNA의 대략적인 구조를 분석한다.

 

 

 

제한효소

DNA의 특정한 염기배열을 식별하고 이중사슬을 절단하는 엔도뉴클레아제(핵산분해효소의 하나)로서 유전공학에서 재조합 DNA를 만들기 위해서 사용하는 특수한 효소이다. 제한효소는 그 특성(절단양식이나 활성발현인자 등)에 의해 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ형의 3군(群)으로 대별된다.

 

Ⅰ형효소는 활성발현에 ATP, S-아데노실메싸이오닌 및 마그네슘이온(Mg²⁺)을 필요로 하고, DNA 속의 인식염기배열로부터 떨어진 부위를 절단하는데 그 위치는 일정하지 않다.

 

Ⅱ형효소는 유전공학에서 널리 사용되는 것으로 활성발현에 마그네슘이온을 필요로 하여 DNA분자의 특정한 염기배열을 인식하고 그 부위 또는 인식염기배열로부터 일정 염기 떨어진 인접부위를 정확하게 절단한다. 또 이 효소의 인식염기배열은 3～6개의 2회전 대칭구조를 취하고 있는 경우가 많다.

 

Ⅲ형효소는 활성발현에 ATP와 마그네슘이온을 필요로 하고, DNA 속의 인식염기배열로부터 수십 염기 떨어진 부위를 절단한다. 제한효소는 이미 200여 종 이상 발견되었고, 생산균주(菌株) 고유의 특이성을 나타내기 때문에 생산균의 속명(屬名)의 머리글자 1문자, 종명(種名)의 머리글자 2문자 및 주명(株名)을 붙여 써서 표시한다. 같은 균주가 2종 이상의 제한효소를 생산하는 경우에는 순차적으로 로마숫자를 첨가하는 명명법이 널리 사용되고 있다. 예를 들면, 대장균 Escherichia coli의 B주에서 발견된 제한효소는 Eco B라고 표기하며, 이것은 Ⅰ형효소이다. 같은 대장균 RY13의 경우는 Eco RⅠ이고, 또 R245의 경우는 Eco RⅡ가 되며, 모두 Ⅱ형효소이다.

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실험 방법

1. 실험 과정

1) 2개의 Micro-tube를 준비한다

 

2) 1번 Micro-tube에는 Lambda DNA 5㎕ 와 증류수 15㎕를 넣어준다. 2번 Micro-tube에는 Lambda DNA 5㎕, EcoRI 1㎕, 10x EcoR1 buffer R 2㎕, 증류수 12㎕를 넣어준다（DNA와 제한효소는 –20℃보관이기 때문에, 상온에 오래 방치하면 되면 효소의 활성이 떨어질 수 있다. 따라서 비커에 얼음을 채워, 올려 두고 사용한다. 이때, 냉동실에서 꺼낸 직후 이기 때문에 DNA와 제한효소가 얼어있는 상태일 수 있다. 상온에 꺼내서 얼음위에 두고 조금기다리면 녹기 때문에, 그 이후 사용하면 된다. 사용한 직후에는 바로 냉동실에 다시 집어넣어 보관한다.）

 

3) 1번과 2번 solution을 Incubator 37℃에서 1시간정도 반응시켜준다.

 

4) 50X TAE buffer를 1X TAE buffer 1L가 되도록 dilution한다.

 

5) 1X TAE buffer 50㎖에 Agarose 질량이 1%(weight/volume)가 되도록 넣어주고 전자레인지에 넣기 전에 용액의 뚜껑은 반정도만 닫는다. 전자레인지에 2분정도 가열한다. （전자레인지 내에서 끓어 넘칠 수 있으므로, 20초-30초 단위마다 전자레인지를 멈춰 용기를 꺼내서 흔들어 준 후 다시 돌린다. 또한 뜨거우므로 화상을 입지 않도록 주의한다.）

 

6) 상온에서 만졌을 때 손이 따뜻한 정도보다 조금 뜨거운 정도가 됐을 때 Red safe(냉장보관)를 전체의 1/20000이 되도록 넣는다.

 

7) Red safe를 넣은 agarose gel을 large tray가 꽂혀있는 gel box에 부은 후, 넓은 comb방향으로 꽂고 굳을 때 까지 기다린다.

 

8) 냉동실에 있는 DNA maker 1㎕와 6x loading buffer 1㎕, 증류수 4㎕의 solution을 Micro-tube에 만들고, heat block 65℃에서 5분간 반응시킨다.

 

9) 반응한 DNA marker를 3분간 얼음에서 cooling한다.

 

10) 2)번에서 사용한 Micro-tube에 6x loading buffer가 1x가 되도록 각각 4㎕를 넣어준다.

 

11) 전기용동기에 굳은 gel을 조심스럽게 엄지 손가락으로 밀어내어 올려두고 1x TAE buffer에 잠길 정도록 넣어준다.

 

12) Agarose gel에 DNA marker 3㎕ 와 8)번 solution 5㎕를 각각 well에 넣어준다.

 

13) 전기영동기를 스위치를 누른 후, gel의 2/3 정도에 bromophenol blue가 오면 멈추고 겔을 uv-transilluminator로 관찰한다. （대략 40분 정도 소요）

 

14) DNA band를 확인하는 UV illuminator의 덮개를 열고, 증류수를 조금 뿌려서 조심스럽게 킴테크로 살살 먼지를 닦아낸다. 그 위에 전개가 끝난 gel을 조심스럽게 올려놓은 후, UV를 켜고 band 위치를 확인한다. (박스로 덮어서 관찰하는 등, 주변을 어둡게 하고 봐야 더욱 선명하게 band를 관찰할 수 있다.

 

 

 

[화공생물공학실험]DNA 제한효소 레포트