생화학실험 | 단백질 정량(Lowry 법)

 

 

 

TIP

 

 

어수리의 추출 희석액으로부터 어수리의 단백질을 Lowry법으로 정량한다.

 

 

 

Lowry법

알칼리성에서 단백질의 peptide 결합과 구리가 반응하여 Cu2+이온을 생성하는 Biuret 반응의 원리를 이용한 것이다. 발색의 정확한 기작은 밝혀지지 않았지만 Cu2+ 이온은 방향족 아미노산의 산화를 유도하여 phospomolybdotungstate를 푸른색의 heteropolymolybdnum으로 환원시킨다. 이러한 반응 결과 강한 푸른색을 생성하며 그 강도는 tryptophan과 lysine양에 영향을 받는다. 이 방법은 단백질의 농도가 0.01～1.0㎎/㎖의 경우에 측정가능하다.

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실험 방법

1. 실험 과정

1) 교반 추출액(10000ppm 용액)을 1000ppm으로 희석하여 마이크로튜브에 넣고 Vortex한다.

교반 추출액을 희석할 때는 70% 에탄올을 용매로 사용한다.

 

2) BSA 용액(10000ppm 용액)을 1000ppm, 500ppm, 250ppm, 125ppm, 62.5ppm ,0ppm 순서대로 희석하면서 Vortex하고, 마지막 마이크로튜브에는 증류수를 1㎖ 넣는다.

① BSA 용액을 희석할 때는 증류수를 사용한다.

② 1000ppm 제조 시에는 용액과 증류수를 1:9의 비율로 희석하고, 1000ppm 용액부터는 5:5의 비율로 차례대로 제조한다.

 

3) 희석한 BSA 용액을 차례대로 rack에 꽂고, 새로운 rack에 마이크로튜브를 각희석한 튜브당 4개씩 준비하여 각 튜브당 100㎕씩 취해 새로운 4개의 마이크로 튜브에 넣는다.

① rack

0	62.5	125	250	500	1000	열수추출시료	어수리 + 70%ethanol
sam	sam	sam	sam	sam	sam	sam	sam
sam	sam	sam	sam	sam	sam	sam	sam
sam	sam	sam	sam	sam	sam	sam	sam
sam	sam	sam	sam	sam	sam	sam	sam

② 윗줄의 세 줄은 희석 시료의 sample(약어 sam), 맨 아랫줄은 blank (folin → 증류수)

③ sam = sample 100㎕ + 시약 1㎖ + 70% 에탄올 100㎕

 

4) 모든 마이크로튜브에 시약ABC용액(A-2% Na₂CO₃ in 0.1 NaOH 50㎖ + B-1% CuSO₄ : ddH₂O 500㎕ + C-2% potassium : ddH₂O 500㎕)을 1㎖씩 넣고 10분간 반응시켜준다.

 

5) blank의 마이크로튜브에는 증류수를 100㎕씩 넣어준다.

 

6) 2N Folin-Ciocailteau’s 용액을 각 sample이 들어있는 blank를 제외한 마이크로튜브에 100㎕씩 넣고, vortex하고 30분간 반응시켜준다. 색이 진보라색을 형성한다.

 

7) 모든 반응이 끝나면 각각의 sample에서 150㎕씩 취해 96 well plate에 순서대로 넣어준다.

 

8) 분광광도계에 96 well plate의 커버를 열고 올바른 방향으로 넣어 흡광도를 측정해준다. OD 값을 750㎚에서 측정한다.

 

9) sample의 흡광도 측정값에서 blank의 측정값을 빼고 표준곡선을 그려서 상백 피(시료)의 단백질 함량을 측정한다.

 

 

 

[생화학실험]단백질 정량(Lowry 법) 레포트