생화학실험 | 단백질의 정량분석

 

 

TIP

 

 

Lowry method와 Bradford method를 사용하여 단백질(protein)의 농도를 측정한다.

 

 

 

단백질의 정량

시료 내에 포함된 단백질의 양, 또는 농도를 구하는 과정으로 280 ㎚에서 흡광도를 측정하는 방법과 단백질의 농도에 따른 색의 변화를 이용하여 분석하는 방법이 있다. 색의 변화를 이용하는 비색정량분석 (colormetric analysis)에는 Bradford법, Biuret법, Lowry법, Bicinchoninic acid법 등이 있다.

 

280 ㎚의 파장에서의 흡광도 측정 방법은 tyrosine이나 tryptophan 잔기의 흡광도를 측정하는 방법으로 장점으로는 분석이 빠른 것을 들 수 있으며, 단점으로는 tryptophan의 함량 변화에 따라 흡광도가 틀려지고 같은 파장의 빛을 흡수하는 용액 내의 다른 성분들(예; 핵산)의 오염을 들 수 있다.

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실험 방법

1. Folin-Lowry법에 의한 단백질 정량

1) 단백질 표준용액(알부민 1㎎/㎖)을 준비한다.

 

2) 시험관 8개를 준비하고 아래와 같이 시약을 준비한다.

표준용액(㎕)	0	10	20	40	80	160	250		미지시료(㎕)	100
증류수(㎕)	250	240	230	210	170	90	0		증류수(㎕)	150

 

3) 시약 A,B,C를 제조하고 98:1:1의 비율로 섞는다.(넉넉하게 25～30㎖정도 제조한다.)

시약A : 0.1M NaOH + 2% Na₂CO₃

시약B : 1% CuSO₄‧5H₂O

시약C : 2% 타르타르산 칼륨ㆍ나트륨

 

4) Folin-Ciocalteau 시약을 250㎕를 신속하게 가하고 즉시 섞어준다.

 

5) 실온에서 30분간 방치 후, 600㎚에서 흡광도를 측정한다.

 

6) 엑셀 등을 이용해 표준곡선 그래프로 그리고 미지시료의 농도를 계산한다.

 

2. Bradford법에 의한 단백질 정량

1) 단백질 표준용액(알부민 0.2㎎/㎖)을 준비한다.

 

2) 시험관 8개를 준비하고 아래와 같이 시약을 준비한다.

표준용액(㎕)	0	5	10	20	40	80	100		미지시료(㎕)
증류수(㎕)	100	95	90	80	60	20	0		100

 

3) 단백질 정량시약 Coomassie blue를 5㎕씩 모든 시험관에 넣어준다.

 

4) 시약을 가한 후 2분이 지난 후부터 흡광도를 측정하여 1시간 이내에 모든 시료의 흡광도를 측정해야 한다. Blank의 흡광도를 0으로 맞추고 595㎚에서 시료의 흡광도를 측정한다.

 

5) 위 결과를 가지고 표준곡선을 그래프로 그린 후 미지시료의 농도를 계산한다.

 

 

 

[생화학실험]단백질의 정량분석 레포트