생화학실험 | 단백질 분리정제 및 기능분석 - buffer 만들기

 

 

 

TIP

 

 

1M의 Tris-HCl (pH7.4), NaCl, MgSO₄, Stock solution 을 제조한 후 다양한 NaCl 농도의 elution buffer 를 만든다.

 

 

 

DEAE sepharose anion exchange chromatography

이온-교환 크로마토그래피(ion-exchange chromatography)법은 주어진 pH에서 단백질이 가지는 알짜 전하(net electric charge)의 하전성과 전하량의 차이에 의해 분리하는 방법이다. 관 속의 기질은 합성 중합체(수지,resin)로서 전하를 띤 기를 가지고 있는데; 양이온 기를 가지는 경우 양이온 교환체(cation exchanger)라고 부르며, 음이온 기를 가지는 경우 음이온 교환체(anion exchanger)라고 부른다.

 

각 단백질의 관 내 이온기에 대한 친화도는 pH와 용액 내의 경쟁적 유리 염 이온들의 농도에 의해 영향을 받는다. 기질에 결합된 단백질의 분리는 이동상(용액)의 pH 그리고/또는 염 농도를 단계적으로 변화시켜 pH나 염의 농도 기울기를 구축하면 분리를 최적화시킬 수 있다. 음이온 교환체(anion exchanger)에서 기질은 일정한 pH에서 양전하를 띠는 작용기를 갖는다. 이동상에서 알짜 음전하를 띠는 단백질은 알짜 양전하를 띠는 단백질보다 기질을 느리게 통과한다. 왜냐하면 알짜 음전하를 띠는 단백질의 경우 고정상과의 상호작용에 의하여 이동속도가 더 지체되기 때문이다. 따라서 더 많은 알짜 양전하를 가진 단백질이 더 빨리 이동하여 먼저 용출된다. Diethylaminoethyl(DEAE) 의 경우 (+)전하를 띠고 있어 음이온 교환체(anion exchanger)에 이용해 단백질을 정제 할 수 있다

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실험 방법

1. 실험 과정

1) Weigh paper 를 전자저울에 올려 놓고 0.0에 맞춘다.

 

2) Tris-HCl (pH 7.4) 1M 50㎖ 를 만들기 위해 Tris 6.06g을 전자저울 위 weigh paper에 spatula를 이용해 덜어낸다. (Tris의 분자량은 121.14g/㏖)

 

3) Weigh paper 위 Tris와 삼차증류수 30㎖를 비커에 넣고 마그네틱 바와 stirrer로 녹인다.

 

4) pH미터기를 표준buffer pH4.01과 pH7.00을 이용해 calibration 한다. (pH미터기 사용법과 주의사항참고)

 

5) Tris용액을 pH미터기로 측정하면서 pH가 7.4가 될 때까지 HCl을 파이펫으로 첨가한다. 마그네틱 바와 stirrer로 계속 섞어주고 마그네틱 바가 유리전극에 닿지 않도록 조심한다. HCl을 pipetting 할 때는 처음 두세번은 파이펫의 최대용량을 첨가하고 pH가 7.4에 가까워졌을 땐 한 방울씩 떨어뜨린다.

 

6) Tris-HCl 용액을 50㎖ 튜브에 옮기고 부피가 50㎖ 가 될 때까지 삼차증류수를 부어준다.

 

 

 

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