일반생물학실험 | 원핵생물 현미경 관찰 - 미생물 : 그람염색(Gram Staining +,-)

 

 

 

TIP

 

 

1. 세포는 모든 생물의 기능적, 구조적 기본 단위이다. 원핵 세포를 가진 세균들을 미생물 감별염색법 중 하나인 그람염색을 통하여 그 원리와 방법을 이해하고 그람양성균과 음성균의 판정을 내린다.
2. 현미경의 원리, 종류, 사용법을 익힌다.
3. 미생물의 관찰 및 형태학적 특성을 알아본다.
4. 미생물의 염색의 목적과 원리를 알아본다.
5. 염색방법의 종류와 특징을 알아본다.

 

 

 

그람 염색(Gram Staining)

세균학에서 가장 많이 쓰이는 염색방법이며, 염색 과정에서 가장 중요한 것은 1차 염색의 탈색이다. 그람 염색 결과 자주색으로 염색되는 세균의 경우 그람양성균이며, 분홍색으로 염색되는 세균은 그람음성균이다. 이 때 양성과 음성은 전기적인 성질과는 관련 없으며 형태학적인 차이를 나타낼 뿐이다. 즉, 그람 염색의 원리는 그람 양성균과 음성균의 세포벽의 화학적, 물리적 차이에 의하여 염색액의 투과성에 차이가 생긴다는 투과성 이론에 있다. 1884년 Hans Christian Gram에 의해서 처음으로 개발된 방 법으로, 각종 균을 염색하여 현미경 적으로 관찰하며 감염질환의 조기 진단에 이용된다고 한다. 그람염색은 4가지 시약을 사용하며 각 시료는 다음과 같다.(염색방법)

 

1) 1차 염색 시약(Crystal Violet) : 보라색의 염료. 고농도로 장기간 실험동물에 먹이게 되면 암을 유발하는 것으로 알려졌다. 염기성 색소인 크리스탈 바이올렛으로 염색하면 그람 양성균과 음성균 모두 자주색으로 염색된다.

2) 매염제(Gram Iodine) : 착색단계. 1차 염색 시약을 cell 내에 강하게 고정시키기 위하여 사용되는 것으로 세포내의 불용성의 CVI 복합체 (Crystal violet iodine)가 형성되어 모든 cell은 전부 자주색을 띈다.

3) 탈색제(95% Ethanol) : 착색된 세균에 탈색제인 알코올 시약을 처리하면 착색된 CV-I복합물이 용해된다. 이때 그람 음성균이 탈색되어 백색으로 보인다. OH기(Alcohol기)를 가지고 있으며 휘발성과 가연성을 가지고 있는 물질이다. 알코올 성분이 두꺼운 펩티도글리칸층을 탈수시켜 수축시키며 세포벽의 구멍을 막아버린다.

4) 염색제 : 사프라닌 (safranine). 대조염색. 염기성 색소인 사프라닌으로 대비염색을 하면 백색으로 탈색되었던 그람 음성균은 분홍색으로 염색된다.

 

 

그람양성균과 그람음성균이 서로 다르게 염색되는 것은 세포벽의 구조가 다르기 때문이다. 세균의 세포벽은 펩티도글리칸이라고 하는 물질이 존재하기 때문에 아주 단단하다. 그람양성균의 세포벽은 여러층의 펩티도글리칸 층이 두껍게 감싸고 있는데 세포벽의 약 80～90% 가량이 펩티도글리칸으로 이루어져 있다. 반면에 그람음성균의 세포벽은 펩티도글리칸 층이 한 겹으로 매우 얇으며 외부에는 인지질 등으로 구성된 외막이 감싸고 있는 형태로 이루어져 있다. 그람음성균의 세포벽은 10～20% 가량 펩티도글리칸으로 이루어져 있다.

 

그람양성균의 CVI 복합체가 탈색되지 않는 이유는 탈색제인 95% Ethanol이 여러 층의 펩티도글리칸을 탈수시켜 분자간의 간격을 좁히므로 CVI 복합체가 세포 밖으로 빠져나오지 못하기 때문에 자주색이 남는 것이다. 반면에 그람음성균의 경우는 인지질 등으로 이루어진 외막이나 세포막이 95% Ethanol에 쉽게 용해되며 한겹의 얇은 펩티도글리칸층은 CVI 복합체를 막기 어렵기 때문에 쉽게 탈색된다.

 

Crystal Violet으로 염색했을 때 Crystal Violet은 염기성 색소이기 때문에 염색하면 그람양성균, 그람음성균이 모두 자주색으로 염색된다. 염색된 세균에 Iodine 용액을 처리하면 Crystal Violet과 Iodine이 반응하여 cell 내의 불용성의 복합체인 CVI를 형성한다. 따라서 그람양성균과 그람음성균 모두 자주색으로 보이게 된다. 탈색제인 95% Ethanol로 탈색을 할 경우 착색되었던 CVI 복합물이 용해된다. 이 때 그람양성균과 그람음성균이 모두 같은 반응을 보인다.

 

 

그람양성균의 경우 CVI 복합물이 cell 내에 그대로 남아있지만, 그람음성균은 탈색된다. 분홍색의 사프라닌으로 대비염색을 하면 탈색되었던 그람음성균은 분홍색으로 염색된다. 하지만 자주색으로 염색된 그람양성균은 영향을 받지 않고 그대로 자주색으로 보이게 된다.

 

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실험 방법

1. 실험 과정

1) 슬라이드 글라스에 세균을 묽게 도말 한다.

 

2) 얇게 도말 된 세균을 열 고정한다.

 

3) 크리스탈 바이올렛을 1～2방울 떨어뜨린뒤 1분 동안 염색한다.

 

4) 염색되지 않은 크리스탈 바이올렛을 증류수로 제거한다.

 

5) 요오드 용액을 1～2방울 떨어뜨려 매염한다.(염색약이 탈색되지 않게 주의 한다.)

 

6) 증류수로 씻는다.

 

7) 95% 에탄올로 10～20초간 탈색한다.(비스듬히 기울이고 에탄올을 흘려서 색소가 더 이상 빠지지 않을 때 까지 탈색시킨다.)

 

8) 증류수로 씻어낸다.

 

9) 사프라닌으로 20초간 염색한다.

 

10) 증류수로 행군 뒤, 상온에서 말려 현미경으로 세포를 관찰한다.

 

11) 위 과정을 반복하여 아래 3가지 세균을 관찰한다.

 

 

 

 

[일반생물학실험]원핵생물 현미경 관찰 레포트