생화학실험 | 형질 전환

 

 

 

실험 개요

형질전환이란 외부에서 만들어진 plasmid를 plasmid가 없는 원핵 세포 cell에 넣어 그 원핵 세포가 본래 성질과는 다른 새로운 유전형질을 나타내게 하여 삽입한 plasmid를 대량으로 키우는 과정이다. 형질전환은 폐렴구균을 통해 DNA가 유전물질임을 PCR과 클로닝 등의 방법으로 증명했다. 인슐린의 경우 처음에는 돼지에게서 추출했지만 많은 수요에 비해 공급은 원활하지 못 했고 깨끗하지 않을 수도 있다는 의견 때문에 중지되었다. 그 후, 인간에게서 인슐린을 만드는 단백질(염기서열)을 찾아내어 인슐린을 공급할 방법을 개발해내었다. 형질전환에서 가장 필요한 것은 제한효소이다.

 

제한효소는 하등한 원핵세포들이 면역 작용을 하기 위해 가지고 있는 효소로 한 제한효소는 한 특정 염기서열을 잘라내는 기능을 한다. 주로 제한효소는 E.coli(대장균)를 사용하며, 제한효소는 plasmid의 특정 부위를 잘라내어 그 사이에 원하는 염기서열을 넣는다. 이때 plasmid가 가지고 있는 염기서열을 그냥 잘라버리면 제 기능을 못하기 때문에 염기서열에 인(P)를 붙여 숙주 세포가 다른 염기서열로 인식하게 한다. 그렇게 만들어진 plasmid가 endocytosis로 숙주 세포의 지질이중층을 막융합을 통해 통과하여 인슐린 과정에 들어가면 인슐린 추출이 완성된다. 이 과정을 클로닝이라고 한다.

728x90

 

 

실험 방법

1. 배지 만들기 (ampicillin)

1) LB Medium (Luria-Bertain Medium)

① 메스실린더에 약 45㎖의 증류수를 담았다.

 

② 전자저울에 X자로 접었다 편 유산지를 올리고 tryptone, yeast extract, NaCl이 모두 포함되어 있는 kit를 1.25g 저울하여 병에 넣고 병을 둥글게 돌리며 잘 섞어주었다.

 

③ 잘 섞인 용액을 다시 메스실린더에 넣고 총 50㎖가 되도록 증류수를 추가하였다.

 

④ 50㎖의 용액을 다시 병에 넣고 뚜껑을 꽉 닫지는 않고 조금 열어둔 뒤, 그 위를 정사각형의 알루미늄 포일로 감쌌다.

 

⑤ Autoclave 121, 1.5기압, 15mins (약 1시간 소요)

 

⑥ 손으로 만질 수 있을만큼 식었을 때 항생제 (ampicillin) 0.001% (약 0.5mg)을 넣어주었다.

 

2) LB plate

① 메스실린더에 약 90㎖의 증류수를 담았다.

 

② 전자저울에 X자로 접었다 편 유산지를 올리고 tryptone, yeast extract, NaCl이 모두 포함되어 있는 kit를 2.5g 저울하여 병에 넣고 병을 둥글게 돌리며 잘 섞어주었다.

 

③ 잘 섞인 용액을 다시 메스실린더에 넣고 총 100㎖가 되도록 증류수를 추가하였다.

 

④ 1g의 Bacto-Agar를 저울하여 용액에 넣었다.

 

⑤ 병의 뚜껑을 꽉 닫지 않고 조금 열어둔 뒤, 그 위를 정사각형의 알루미늄 포일로 감쌌다.

 

⑥ Autoclave 121, 1.5기압, 15mins (약 1시간 소요)

 

⑦ 손으로 만질 수 있을만큼 식었을 때 항생제 (ampicillin) 0.001% (약 1.0mg)을 넣어주었다. (형질전환에서 도말하기 전, 10x 희석할 것)

 

⑧ Clean bench에서 페트리디시의 바닥을 덮을만큼 부어 4개의 페트리디시를 채우고 약 20분 간 굳혔다.

 

2. Transformation

1) 100의 DH5가 들어있는 4개의 E-tube를 ice bucket에 넣고 천천히 녹였다. (-70 보관)

 

2)  2개의 E-tube에는 대조군인 pUC 19를 라벨하고 2개의 E-tube에는 실험군인 plasmid DNA(pCMV2)를 Sp로 표기하여 라벨했다.

 

3)  pUC 19의 E-tube에 2의 pUC 19를 넣고 plasmid DNA E-tube에는 2의 plasmid DNA를 넣어 ice bucket에 약 40분 간 보관했다.

 

4)  40분 후, 42로 맞춰진 항온 수조에 4개의 E-tube를 양손에 잡고 안정하게 45초 간 heat-shock 해주었다.

 

5)  45초가 지나면 즉시 ice bucket에 꽂아 2분간 방치해 안정화시켰다.

 

6)  안정화가 끝난 E-tube에 각각 LB medium 0.9㎖씩 넣고 피펫팅 하여 섞어주었다.

 

7)  섞인 sample을 culture용 tube로 옮겨주었다.

 

8)  Shaking incubator에서 225rpm, 37로 1시간 동안 배양해 주었다.

 

9)  배양하는 동안 LB plate/amp+에 대조군과 실험군을 각각 표기해 주었다.

 

10)  표기한 LB plate/amp+에 배양이 끝난 sample을 1:10으로 희석하여 100를 도말한 후, 37의 incubator에서 하룻밤동안 배양했다.

 

3. Plasmid Extraction

1)  Culture용 tube에 배양해 놓은 sample을 E-tube에 1.5㎖를 넣고 1분 동안 원심 분리 후 상층액은 버리고 이 과정을 한 번 더 반복하여 1.5㎖의 sample을 넣고 원심 분리하여 상층액은 버리고 침전물(세포)를 모았다.

2)  E-tube에 250의 buffer P1을 넣고 피펫팅 하여 섞어주었다.

3)  250의 buffer P2를 넣고 4-6번 정도 조심스럽게 뒤집어주며 섞어주었다.

4)  350의 buffer N3를 넣고 4-6번 정도 조심스럽게 뒤집어주며 섞어주었다.

5)  약 10,000rpm에서 10분 간 원심 분리를 해주었다.

6)  원심 분리를 하는 동안에 4개의 spin column과 column tube에 표기를 하여 준비해두었다.

7)  원심 분리가 끝난 tube의 상층액에 plasmid가 들어있으므로 상층액을 피펫을 이용하여 column tube의 벽을 타고 옮겨 담았다.

8)  1분간 원심 분리를 해주고 분리액은 버려주었다.

9)  0.5㎖의 buffer PB를 spin column에 넣고 1분간 원심 분리를 해주어 필터 양성화를 시켜주고 분리액은 버려주었다.

10)  Buffer PE 0.75㎖를 spin column에 담고 1분간 원심 분리를 해주어 세척해 주었다.

11)  에탄올이 남아있으면 실험 진행이 어렵기 때문에 spin column에 아무것도 넣지 않고 1분간 추가로 원심 분리를 해주어 에탄올을 완벽히 제거해 주었다.

12)  Column을 E-tube에 옮기고 50의 buffer EB를 column의 정중앙에 넣고 1분 방치 후, 1분간 원심 분리를 해 주었다.

13)  추출된 분리액은 plasmid DNA이며 저온에 보관해 두었다.

 

3. DNA 전기영동

1)  Agarogse와 1x TAE buffer를 사용하여 gel을 만들었다.

 

2)  2개의 pUC 18과 2개의 실험군 plasmid DNA를 각각 6x loading buffer 1와 피펫팅으로 섞고 Agarose gel의 well에 넣었으며, DNA의 크기를 추측하기 위해 marker를 넣고 30분간 전기영동 하였다.

 

 

 

[생화학실험]형질 전환 레포트