화공생물공학실험 | DPPH

 

 

 

TIP

 

 

ROS Pathway 및 radical에 의한 인체 내 산화적 스트레스에 대해 이해하고, radical 소거활성능 측정법 중 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH)법으로 항산화 활성을 측정한다.

 

 

 

실험 개요

활성 산소종 (reactive oxygen species, ROS)이란 정상적인 세포 내에 활성 작용 과정에서 생성되며 세포 분화나 유전자의 발현, 시토카인에 대한 반응 정도를 포함한 다양한 생물학적 과정과 연관된 물질이다. ROS의 항상성을 유지하는 것이 세포의 성장과 생존에 매우 중요하며 산화 스트레스란 ROS의 생성과 이를 제거하는 항산화 반응 간의 항상성이 깨져 세포 내의 ROS가 증가하여 유전물질이나 단백질 혹은 지질과 반응해 손상시키는 현상이며 이것이 노화와 심혈관 질환의 핵심 원인으로 알려져 있다. 이러한 활성 산소를 없애기 위해 우리 몸에서는 항산화제라는 물질을 만드는데 이는 몸에서 생기는 활성산소를 제거해 산화적 스트레스로부터 인체를 방어하도록 돕는 물질이다.

 

비타민A, 비타민E, 비타민C, 셀레늄, 코엔자임큐10, 카테킨을 포함하는 폴리페놀류 물질이 항산화 작용을 한다. 체내 항산화 효소에는 초과산화물 불균등화효소(SOD, superoxide dismutase), 과산화수소 분해효소(카탈라아제), 글루타치온 과산화효소, 글루타치온 환원효소 등이 있다. 이러한 효소가 제대로 작용하기 위해서는 셀레늄, 구리, 아연, 망간 등의 미량 영양소가 필요하다. 글루타치온, 알파-토코페롤(비타민 E), 비타민 C, 베타-카로틴, 시스테인, 타우린 등이 영양소로써의 항산화제로 잘 알려져 있다. 이러한 영양소들은 세포 시토졸(세포 내 액상 물질)과 혈장에서 산화물질과 반응하여 항산화 작용을 한다. 특히, 글루타치온은 간에서 만들어지는 3개의 아미노산(글루탐산, 시스테인, 글리신)이 결합된 펩타이드로 산화적 손상으로부터 보호하는 매우 강력한 항산화 물질이다. 비타민 C는 대표적인 수용성 항산화 물질이고, 비타민 E는 지용성 물질로 지질 과산화로부터 세포막을 보호한다.

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실험 방법

1. 실험 과정

1) 10 mM DPPH 1 ㎖을 제조하기 위해 A g의 DPPH를 계량해줍니다.

 

2)  계량한 DPPH에 Ethanol을 넣어 10 mM DPPH solution 1 ㎖을 제조합니다.

 

3)  알루미늄 호일로 용액을 감싸줍니다.

 

4)  B ㎖의 Ethanol에 10 mM DPPH를 C ㎖ 넣어서 250 μM DPPH solution 15 ㎖을 제조합니다.

 

5)  제조한 250 μM DPPH를 알루미늄 호일로 감싸줍니다.

 

6)  L-ascorbic acid D g을 계량하여 15 ㎖ tube에 넣어줍니다.

 

7)  L-ascorbic acid를 넣어준 15 ㎖ tube에 증류수 10 ㎖을 넣어 60mM L-ascorbic acid 10㎖을 제조합니다.

 

8)  Gallic acid monohydrate를 E g 계량해줍니다.

 

9)  Naringin F g을 계량해줍니다.

 

10)  계량한 Gallic acid monohydrate와 Naringin에 각각 증류수 10㎖을 채워서 60mM Gallic acid monohydrate 10㎖, 60mM Naringin 10㎖을 제조합니다.

 

11)  Tocopherol G ㎖을 H ㎖의 ethanol에 희석해서 총 10 ㎖의 60 mM Tocophenol을 제조합니다.

 

12)  제조한 60 mM의 네 가지 용액을 각각 증류수 또는 ethanol I ㎖에 용액 J ㎖을 넣어서 각각 총 10 ㎖ 의 200 μM sample을 제조합니다.

 

13)  200 μM, 100 μM, 50 μM, 25 μM, 12.5 μM, 6.25 μM으로 labelling 한 1.5 ㎖ tube를 L-ascorbic acid (=L-a), Tocopherol (=T), Gallic acid (=G), Naringin (=N), 네 가지 용액에 대해 준비해줍니다.

 

14)  제조한 200 μM의 stock solution을 이용하여 labelling 된 농도의 용액을 0.5 ㎖씩 준비해줍니다.

 

15)  제조해 둔 250 μM의 DPPH solution 0.5 ㎖을 14번에서 준비한 용액 0.5 ㎖에 넣어 반응시켜줍니다.

 

16)  암실에서 20분 동안 반응을 진행합니다.

 

17)  6.25 μM의 농도부터 차례대로 큐벳에 옮겨 넣어줍니다.

 

18)  Auto zero를 맞춘 후 517㎚에서 흡광도를 측정합니다.

 

 

 

[화공생물공학실험]DPPH 레포트