생명과학실험 | Specific activity and enzyme kinetics of alkaline phosphatase

 

 

 

TIP

 

 

효소의 활성도를 흡광도를 이용하여 측정하는 방법과, specific activity의 개념을 이해하고, enzyme kinetics에서 기본이 되는 M-M equation과 Linear-burk equation을 이용행서 효소활성의 척도가 되는 K_m,V_max,k_cat 등을 실험적으로 측정한다.

 

 

 

Specific activity of Enzyme

단위 질량 당 효소의 활성을 말하며, 효소활성을 단백질의 단위중량당으로 나타낸 것. 일반적으로 활성의 단위는 비〔U/㎎〕로 나타낸다. 효소 이외의 불순한 단백질이 적을수록 비활성이 높아지기 때문에 효소정제의 척도가 된다.

효소의 정제 순도가 높을수록 specific activity가 증가한다.

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실험 방법

1. Bradford assay (단백질 정량)

1) 정제한 AP sample 중에서 AP가 가장 많이 검출될 것이라고 추정되는 sample을 1개 고른다.

 

2) BLANK를 만든다.

 

3) PM과 200-1을 가지고 흡광도를 측정할 solution sample 1, 2를 만든다.

 

4) 만든 sample들을 vortex하여 잘 섞은 뒤 상온에서 10분 간 반응시킨다.

 

5) 595㎚에서 흡광도 (A₅₉₅)를 측정한다.

 

6) BSA standard curve로부터 sample의 단백질 농도를 구해낸다.

 

2. AP의 specific activity 측정

1) Bradford assay를 통해 얻은 단백질 농도를 이용하여 200-1과 PM을 0.1ug/㎕으로 희석해 준다. 이때 total volume은 500㎕로 한다.

 

2) 1mM의 PNPP 1㎖에 농도를 일정하게 맞춘PM과 200-1을 1ug씩 넣고 vortex해준다. 그 후 상온에서 정확히 1분씩 반응시킨다.

 

3) NaOH 50㎕를 넣고 volte× 해준다.

 

4) 405㎚에서 흡광도 (A₄₀₅)를 측정한다.

 

5) Specific activity를 구한다. (단 1분에 1µ㏖e의 PNP를 생성하는 효소의 활성을 1unit으로 정의한다)

 

6) 정제 전후의 specific activity를 비교하여 정제 효율을 계산한다.

 

3. PNPP의 농도 차에 따른 AP의 specific activity 측정

1) Bradford assay를 통해 얻은 단백질 농도를 이용하여 200-1을 0.1ug/㎕으로 희석해 준다. 이때 total volume은 500㎕로 하며 enzyme dilution buffer를 사용하여 희석해 준다.

 

2) 1mM PNPP를 serial dilution하여 500µM, 250µM, 100µM, 50µM, 25µM, 12.5µM, 6.25µM PNPP를 1㎖씩 만든다.

 

3) BLANK를 만들어 준다.

 

4) 각 농도의 PNPP 1㎖에 1)에서 만든 200-1을 각각 10µl씩 넣고vote×한 뒤 10초간 반응 시킨다.

 

5) 10초 후 바로 NaOH 50µl를 넣고 volte×를 한다.

 

6) 405㎚에서 흡광도 (A₄₀₅)를 측정한다.

 

 

 

[생명과학실험]Specific activity and enzyme kinetics of alkaline phosphatase 레포트