일반생물학실험 | 동물세포의 유사분열 염색체 관찰

 

 

 

TIP

 

 

두 가지 방법을 통해 동물세포의 유사분열 염색체를 관찰할 수 있다.

 

 

 

실험 방법

1. Preparation of Mouse Metaphase Chromosomes

1) 배양된 B16F10의 media에 colchicine(10㎎/㎖)을 4㎍/㎖이 되도록 첨가한다. ⇒ ( Total medium 10㎖에 4㎕)

 

2)  2시간 동안 37℃ incubator에서 배양한다.

 

3)  Media를 제거하고 1X PBS 5㎖로 washing한 후 0.5% Trypsin-EDTA를 1㎖ 처리한다.

 

4)  3∼5분간 37℃에 둔 후 media(+FBS) 4㎖을 넣고 pipetting하여 cell을 50㎖ conical tube로 옮겨준다.

 

5)  상온의800rpm에서 3분간 원심 분리한다.

 

6)  Media을 제거하되 500㎕ 정도의 medium을 남긴다. 남긴 media로 pellet을 pipetting하여 풀어준다.

 

7)  1 ㎖의 0.075M KCl을 pipet을 이용해 한 방울씩 천천히 넣어준다.

 

8)  4 ㎖ 0.075M KCl을 더 넣어준 후 (Total 5㎖) inverting하여 잘 섞어 준다.

 

9)  37°C incubator에서 15분 둔 후, 상온의800rpm에서 3분간 원심 분리한다.

 

10)  500 µl 정도의 KCl 용액을 남기고 제거 한 뒤, pipetting하여 pellet을 풀어준다.

 

11)  1㎖의 고정용액(methanol 3 : acetic acid 1)을 pipet을 이용하여 한 방울씩 천천히 넣어준다.

 

12)  4㎖의 고정용액을 더 넣어준 후 inverting하여 섞어 준 뒤, 10분 간 상온에 둔다.

 

13)  상온의 800rpm에서 3분 간 원심 분리한다.

 

14)   10번 과정과 동일하게 실시한다.

 

15)   5㎖의 고정용액을 넣고 inverting한 후 상온의 800rpm에서 3분 간 원심분리한다.

 

16)   pellet 이외의 용액을 제거한다. (pellet이 쉽게 풀리기 때문에 집중력을 요함)

 

17)   1㎖의 고정용액으로 pellet을 잘 풀어준다.

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2. Spreading & Staining of Mouse Metaphase Chromosomes

1) 슬라이드 글라스를 45도로 기울여 준비한다.

 

2)  준비한 세포현탁액을 슬라이드 글라스로부터 위로 약 15∼30㎝ 떨어진 지점에서 떨어뜨린다. ⇒ (슬라이드 글라스의 한 지점을 정하여 8방울∼10방울 정도 떨어뜨린다. 단, 위쪽을 목표로 하여 현탁액이 아래로 흐를 수 있도록 떨어 뜨려준다.)

 

3)  슬라이드 글라스를 5∼10분간 말린 후 Giemsa 용액에 10분 간 staining한다. ⇒ ( + DAPI staining = DAPI 염색 후 cover glass를 덮고 TDW로 washing > 형광 현미경으로 관찰)

 

4)  TDW에 5분 destaining한다.

 

5)  커버글라스를 덮은 뒤 현미경 배율을 400x에서 1000x로 높이면서 염색체를 관찰한다.

 

 

 

[일반생물학실험]동물세포의 유사분열 염색체 관찰 레포트