미생물학실험 | 생균수 측정 실험(MPN법)

 

 

 

TIP

 

 

대장균을 이용한 생균수의 측정법과 정의를 알아본다.

 

 

 

MPN법(Most Probably Number)

시료에 있는 균수를 최적합수법에 의해 산출하기 위해서이다. 최적합수, Most Probably Number란 통계학적으로 가장 확실한 수치를 말하며 옛날부터 공식적으로 사용하고있는 확률론적 추계방법이다. MPN법은 연속 희석한 일련의 시료를 액체배지가 든 여러 개의 시험관에 접종하고 배양하여 자라는 시험관의 수를 세어 통계학적인 방법으로 시료 속의 미생물 밀도를 결정하는 방법으로써 다중시험관 발효법이라고도 한다. 이 방법에서는 최소한 시료를 3단계까지 연속 희석하는데, 10㎖, 1.0㎖, 0.1㎖, 0.01㎖ 과 같이 순차적으로 10배마다 희석해 각 5개씩 시험관을 가진다.

 

이렇게 복수 배양한 시험관들에게서 단순히 기포발생 여부에 따라 양성반응과 음성반응만을 확인한다. 5개중 적어도 1개는 음성반응이 나오도록 시료를 희석하는 것이 필요하고 미생물이 자란 양성반응 시험관들을 희석배율 단계별로 세어 MPN표로 찾아 희석배수를 환산한 후 미생물의 밀도를 MPN/100㎖ 로 나타낸다. MPN법에서 중요한 것은 양성/음성반응을 구분하는 것으로 배지의 탁도, 색깔 변화, 기포의 발생 여부 등을 기분으로 삼는다. MPN법으 이점은 액체배지를 사용하므로 유기물 오염을 야기할 수 있는 한천의 사용을 배제할 수 있다는 것이다.

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실험 방법

1. 추정 실험

1) 70% 에탄올로 실험대를 닦고 알코올 램프를 켜서 무균상태를 만든다.

 

2) 파이펫 에이드를 이용해 무거천 물을 10㎖씩 2XLB배지(액체)가 들어있는 5개의 test tube에 기포가 생기지 않도록 주의해서 넣는다.

 

3) 무거천 물을 파이펫으로 1㎖씩 1XLB배지(액체)가 들어있는 5개의 test tube에 기포가 생기지 않도록 주의해서 넣는다.

 

4) test tube에 9㎖ PBS와 1㎖ 무거천 물을 섞어 희석시킨다.

 

5) 희석된 시료를 1㎖씩 1XLB배지(액체)가 들어있는 5개의 test tube에 기포가 생기지 않도록 주의해서 넣는다.

 

6) 시험관마다 durham tube를 뒤집어서 넣고 37℃에서 24시간동안 배양한다.

 

2. 확정 실험

1) 0.1㎖, 1㎖, 10㎖ 시험관마다 durham tube에 기포가 생겼는지 확인한다.

 

2) 기포가 생긴 양성관들은 그 개수만큼 접종한다.

 

3) 접종방법: 1회용　백금이를 굳은 LB배지에 배지 중간까지 수직으로 넣었다가 빼고 EC배지 또는 BGLB배지에 각각 넣고 휘젓는다. 접종한 배지는 한번 더 흔들어준다.

 

4) 시험관마다 durham tube를 뒤집어서 넣고 EC배지는 44℃ 24시간, BGLB배지는 37℃ 48시간 배양한다.

 

5) 24시간 배양한 EC배지 0.1㎖, 1㎖, 10㎖ 시험관마다 durham tube에 기포가 생겼는지 확인한다.

 

6) EMB배지(평판고체배지)에 1회용 백금이를 이용해 0.1㎖, 1㎖, 10㎖ 각각 1개씩 3차 streaking 한다. 도말한 EMB배지는 37℃ 24시간 배양한다.

 

7) 48시간 배양한 BGLB배지 0.1㎖, 1㎖, 10㎖ 시험관마다 durham tube에 기포가 생겼는지 확인한다.

 

8) 24시간 배양한 EMB배지의 균 집락들을 관찰한다.

 

 

 

[미생물학실험]생균수 측정 실험(MPN법) 레포트