생화학실험 | Bradford assay

 

 

 

TIP

 

 

미리 농도를 알고 있는 Standard 용액을 이용하여 농도를 모르는 sample의 농도를 구할 수 있다.

 

 

 

Bradford Assay

용액의 단백질 농도 정량법은 생화학 연구에서 자주 사용되는 중요한 기술이다. 정량법으로 여러 가지 방법들이 개발되었으나 민감도가 각각의 측정법마다 다르고 반응에 사용하는 시약들이 특정한 아미노산과만 반응하기 때문에 한가지로 모든 단백질의 농도를 정량하기는 힘들다.

 

UV-Visible spectrophotometer를 이용, 흡광도를 측정하여 standard물질인 BSA(Bovine Serum Albumin)나 BGG(Bovine Gamma Globulin)를 기준으로 자신의 시료에 단백질이 얼 마만큼 들어있는지 측정하는 방법 중 하나이다. 신속하고 간편하게 단백질을 정량할 수 있 어 널리 쓰인다. Dye로는 Coomassie Blue G-250를 사용하며, 이 dye가 단백질과 결합해 생기는 파장의 변화를 측정한다.

 

Acidic environment reagent 조건 하에서 단백질은 Coomassie dye에 결합하는데 이 결과로 reddish/brown form(465nm에서 최대 흡광)이던 dye는 blue form(610nm에서 최대 흡 광)으로 스펙트럼 이동이 일어나게 된다. 두 가지 form의 차이는 595nm에서 최대가 되는 데, 따라서 이 파장이 Coomassie dye-protein complex의 blue form을 측정하는데 최적의 파장이 된다. 575nm～615nm사이의 어느 파장에서든 blue form을 측정할 수는 있지만 595nm에서 측정한 것보다 측정되는 흡광도 값이 10%정도 낮아지게 된다.

 

Bradford protein assay에서 Coomassie dye ligand는 단백질의 positive charged된 부 분에 결합하기 때문에 basic amino acid인 arginine, lysine, histidine 잔기가 필요하다.(주로 dye와 작용하는 amino acid는 arginine이다) 또한 Dye-protein complex를 형성하기 위해 van der Waals, hydrophobic interaction도 작용하며, 단백질의 크기 또한 영향을 미친다. 일반적으로 3000Da 미만의 단백질은 Bradford assay로 정량할 수 없다.

 

 

Bradford assay는 실온에서 사용가능하며, 어느 특별한 장비를 필요로 하지 않는다.(Spectrophotometer, cuvette, dye정도가 필요하다) 어느 단백질이든 동일한 dye를 더해 준 후 약 5분 정도 반응시키고, 595nm에서 흡광도를 측정하기만 하면 되는 간단한 방법이 지만, 대신 Coomassie dye가 염, detergent, 지방 등에 의해 쉬이 영향을 받는다는 단점이 있다. 특히나 sample에 계면 활성제(surfactant)가 조금이라도 존재하는 경우, 정량값이 크 게 영향을 받게 되는데, 이는 dye로 사용하는 Coomassie blue가 acidic하기 때문이다.

 

단백질에 따라 Coomassie dye와 결합하는 정도도 조금씩 다를 수 있으므로 주의가 필요 하다. 이런 발색을 이용한 단백질의 정량은 시간이 지날수록 결과값이 달라지는 경우가 생 기기 때문에 되도록 빠른 시간내에 시행해야 한다.

 

단백질의 정량을 위해서는 standard가 필요한데, BSA(Bovine Serum Albumin)나 BGG(Bovine Gamma Globulin)를 이용해 standard curve를 얻을 수 있다.

 

여러 농도의 BSA or BGG(반드시 0농도를 포함해야 한다)를 만들어 dye를 넣은 후 반응 시켜 595nm에서 흡광도 측정을 하고 그 결과값을 이용해 standard curve를 그린다. 이 때 cureve는 직선형에 가까울수록 신뢰도가 높아진다. 그런 다음 정량하고자 하는 단백질이 든 sample을 dye처리해 흡광도를 측정해 BSA(or BGG)의 값과 비교해보면, BSA는 이미 농도를 알고 있으므로 sample의 흡광도 결과를 이용해 sample의 농도를 계산할 수 있게 된다.

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실험 방법

1. 실험 과정

(1) 5X Bradford 시약을 1X로 희석한다.

 

(2) BSA Protein으로 Standard 용액을 시험관에 만든다.

 

 

(3) 5분 동안 Standard 용액을 둔다.

 

(4) UV spectrophotometer를 미리 켜서 워밍업을 시키고 Bradford setting을 한다.(파장 595㎚)

 

(5) cuvette을 alcohol과 DW로 깨끗이 닦은 후에 휴지로 겉에 물기를 닦아 내고 cuvette에 pipet으로 (2)에서 만든 standard 용액을 1㎖ 취하여 UV spectrophotometer의 뚜껑을 열어 cuvette넣는 홈에 넣고 뚜껑을 닫고 흡광도를 찍는다.(※ 이때 cuvette의 투명한 부분이 광원과 맞닿도록 cuvette을 넣는다.)

 

(6) (5)과 같은 방법으로 standard 용액 각각 5개의 흡광도를 찍는다.

 

(7) sample 2㎕ + Bradford 시약 200㎕ + 798㎕ DW → 1㎖를 시험관에 만든다.

 

(8) (5)번과 같은 방법으로 (7)번 Sample용액의 흡광도를 찍는다.

 

 

 

 

[생화학실험]Bradford assay 레포트