생명과학실험 | Immunoprecipitation

 

 

 

Immunoprecippitation(면역침강법)

특정 단백질의 존재를 확인하기 위해 그 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여 결합 시키는 방법이다. 이때 보통은 antigen-antibody 만을 넣어 특이적 결합을 시킨다 하여도 그걸 눈으로 확인할 방법이 없으니 그것을 위해 무거운 bead를 넣어 침전물이 발생하게 만든다.

 

이런 Immunoprecippitation의 방법에는 Individual protein immunoprecipitation (IP), Protein complex immunoprecipitation (Co-IP), Chromatin immunoprecipitation (ChIP), RNA immunoprecipitation (RIP) 등의 방법이 있으나 Chromatin immunoprecipitation (ChIP)에 대해서만 자세히 알아 보기로 하자.

 

 

1. Chromatin immunoprecipitation (ChIP)

위의 그림과 같이 genome의 DNA binding site를 이용하여 immunoprecipitation을 하여 protein과 binding하는 DNA를 찾는 방법이다. 이 방법은 cell의 nucleus안에서 일어나는 protein–DNA interaction을 in vitro로 일어나게 하여 실험자의 눈으로 확인할 수 있게 해준다. 또한 어떤 protein과 binding하는 DNA를 찾는데 매우 유용하게 사용되는 실험 기법이다. 이제 위 실험 기법의 원리에 대하여 알아보자. 가장 먼저 위 방법을 이용하기 위해서는 살아 있는 cell안에 DNA-binding protein을 binding할 DNA와 cross-link시켜 둘 사이의 결합을 유지시켜 준다.

 

원래는 DNA와 DNA-binding protein은 cell안에서 binding하여 자기 할 일을 하고 그 일이 끝나면 곧 다시 떨어져 나가기 때문이다. 그 다음 sonication을 하여 물리적 충격으로 주어 cell을 부수고 DNA를 잘게 쪼갠다. 그리고 찾고자 하는 protein에 단일 클론 항체를 넣어 antigen-antibody reaction을 일으켜 준다. 그러면 원하는 protein과 거기에 binding한 DNA가 침강하게 되는데 이때 여기에 열을 가하면 protein과 DNA의 binding이 풀리게 된다.

 

그리고 거기에 원심분리를 해 주면 DNA만을 얻을 수 있다. 얻은 DNA를 sequencing한다면 해당 DNA의 sequence 또한 알아낼 수 있다. 또는 전체 DNA의 sequence와 대조한다면 전체 DNA에서 어느 위치에 해당 DNA가 위치하고 있었는지도 확인 할 수 있다. 그러나 해당 protein이 만약 다른 protein과의 상호작용을 통해 DNA와 interaction하는 protein이었다면 위 실험으로는 DNA-protein interaction을 확인 할 수 없다는 단점이 있다.

 

 

실험 방법

1. 실험 과정

1) 1% NP40 IP buffer 0.5㎖을 pallet에 넣고 suspension한다.

 

2) 20min동안 ice incubation 한다.

 

3) 3sec동안 21%에서 sonication 1회 해준 뒤 뜨거워진 tube를 ice에 박아 식혀 준다.

 

4) 13000rpm 4℃ 20min centrif㎍e 한다.

 

5) Tube의 위에 뜬 soup만 딴 뒤 bradford assay 하여 protein의 농도를 계산해 낸다.

 

6) Protein 1㎎을 bead가 들어 있는 tube에 넣고 1㎖까지 IP buffer를 채워 준 뒤 4’C에서 overnight으로 binding 시킨다.

 

7) 96℃에서 끓여준 뒤 soup만 따서 western blot해 준다.

 

 

 

[생명과학실험] Immunoprecipitation 레포트