동물면역학실험 | 인간 혈액으로부터 말초혈액단핵세포 (PBMC) 분석

TIP

 

 

PBMC안에는 B cell, T cell, macrophage, dendritic cell, NK cell(natural killer cell)등의 면역세포들이 포함되어 있다. 또한 PBMC는 인간 및 여러 동물군의 면역 실험에 많이 이용되고 있는 세포군 이다. PBMC에 있는 여러 세포들의 표면에는 CD 분자들이 있으며, 이 분자들을 통해 세포군 들을 나누고 측정하여 변화 정도를 확인한다. 이러한 변화 측정에는 flow cytometry라는 세포분석 기계를 사용한다. 따라서 본 실험은 혈액의 구성 중 하나인 PBMC만을 혈액으로부터 분리해 내고, 분리 된 PBMC 속 면역세포들의 구성과 변화를 살펴보는 것을 목적으로 한다.

 

 

 

Peripheral Blood Mononuclear Cell (PBMC)

말초혈액단핵세포는 lymphocyte나 monocyte처럼 둥근 모양의 핵을 가지 혈액세포를 말한다. 이러한 혈액세포들은 감염이나 침입자에 대해서 방어하는 면역시스템에서 중요한 구성요소로서 작용한다. Lymphocyte의 population은 T cells (CD4 and CD8 positive)이 75%를 구성하고 있으며, B cell과 NK cells은 25%를 차지하고 있다.

 

 

 

실험 방법

1. Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) isolation from human adult blood

1) Ficoll 용액을 50㎖ tube에 준비

 

2) PBS와 Blood(혈구세포만 농축된 상태)를 1:1로 섞은 후 흔들어서 mixing 해준다.

 

3) 2)번의 mixture를 1)번의 tube에 넣는다. (20㎖ mixture(blood)/ficoll tube)

 

4) centrifuge 1400rpm, 25min, 25℃

 

5) 새로운 50㎖ tube를 준비하고 buffycoat(the layer of PBMC)를 모은다.

 

6) PBS로 washing하기 위해 약하게 잘 섞어준다.

 

7) Centrifuge(2000rpm, 3min) 하여 cell down시키고, 상층액을 제거한다.

 

8) 6), 7)번 과정을 3회 정도 반복하여 washing한다.

 

9) Pellet을 모아서 새로운 tube에 넣고, culture medium에서 cell counting을 한다.

 

10) RPMI 1640 + 10% FBS + 1% antibiotics로 구성된 media를 첨가 → reference a supplement

 

11) 37℃에서 incubation 한다.

 

2. Surface staining

1) Centrifuge(2000rpm, for 3 min)하고 상층액을 따서 버린다.

 

2) PBS를 넣고 V-bottom 96well plate(1× cell/well)로 옮긴다.

 

3) Centrifuge(2000rpm, for 3 min)하고 상층액을 따서 버린다.

 

4) Surface staining

 

5) 10㎕ (diluted antigen)/well ; incubate 20 min, 4 degree in dark room.

 

6) 230㎕/well PBS를 첨가하고 centrifuge(2000rpm, for 3min)한 후, 상층액을 따서 버린다.

 

7) 230㎕/well PBS를 첨가하고 centrifuge(2000rpm, for 3min)한 후, 상층액을 따서 버린다.

 

8) 6)번 과정을 한번 반복.

 

9) 200㎕/well PBS를 첨가하고 FACS tube로 옮긴다.

 

10) 800㎕/tube PBS를 더 첨가해주고 FACS로 관찰한다.

 

 

 

[동물면역학실험]인간 혈액으로부터 말초혈액단핵세포 (PBMC) 분석 레포트