1. TLC의 효율적인 사용법을 익힌다.
2. 박층 크로마토그래피에 정지상과 이동상은 무엇이며 분리 원리는 어떤것인지 혼합색소의 분리를 통해 알아보고, 각각의 값을 비교함으로써 미지의 물질을 확인한다.
3. TLC는 유기화학에서 물질을 확인 할 때 가장 많이 쓰는 방법으로서, 판을 이용하여 시료물질을 성분이 다른 용매에 전개시켜 각각의 Rf값을 구하는 법을 알아본다.
4. 어떤 것을 분리, 분석하는 방법 중 하나인 크로마토그래피 중에 유기화학에서 자주 쓰이는 방법인 TLC의 원리와 특징을 알 수 있다. 그리고 TLC의 사용방법을 배워 복잡한 혼합물을 분리, 분석하는데 도움이 될 수 있다.
실험 배경
전개액 마다 시료가 특정한 Rf값을 가지는 특징을 이용하여 물질의 조성을 판별할 수 있다. 또한 TLC를 이용해 반응과 생성을 감지하고 조절하는데 매우 유용하다. 실험에 적절한 전개액을 모르는 부득이한 경우(본 실험) 여러 가지 전개액을 만들어 모두 사용해본다. 전개액과 시료가 잘 섞일수록 Rf값이 높아진다, 극성과 비극성은 이 Rf값을 조절 할 수 있는 수단이다. 모세관 현상으로 유리 모세관에 시료를 담고, 시료의 TLC플레이트에 대한 부착력으로 아주 얇게 도포가 가능하다.
TLC병(전개병)에 전개액이 포화가 되어 있어야 전개도중에 증발이 일어나지 않는다(적당한 만큼의 휘발성, 적당한 TLC병의 부피), 전개도중 증발이 일어나면 실험 시간은 물론 Rf에도 영향을 미칠 수 있다. 전개액이 TLC판 끝에 다다르기 전에 계속 확인이 필요하지만 전개병의 뚜껑을 열 경우 포화되었던 기체가 나가기 때문에 실험에 오차가 생긴다. 따라서 전개병은 투명한 것이 좋다. 부착력과 응집력의 영향으로 TLC plate에 전개가 일어난다. 자외선을 흡수하는 시료는 자외선을 통해 보면 검게 보인다(일반적인 형광물질은 자외선 흡수율이 높은 물질로 시료나 전개액과의 반응 여부에 따라 소량 첨가해 주어도 된다.)
박층 크로마토그래피
1. 개요 : 정지상이 도포된 평평한 면에서 시료의 분리가 이루어지는 평면 크로마토그래피법의 하나
2. 특징
정지상과 이동상의 선택범위가 넓고, 저렴하고 신속하며 혼합물의 구성패턴, 시료 순도, 분리 분석 조건을 검토하기 위해 유용하게 홀용된다.
3. 지지체의 재질
① 유리 : 고온에서 잘 견디고 자극성 용매나 분무 시약에 대해 내성이 좋아 가장 많이 사용
② 플라스틱판 : 모양의 변형이 가능한 장점
③ 폴리비닐알콜, 아크릴 폴리머 : 적절한 응집력과 경도를 줌
4. 고정상의 종류
① 실리카겔 : 극성물질과 수소 결합을 하는 정도의 차이를 이용하여 물질을 분리
② 변형 실리카겔 : -NH2, diol, -CN과 같은 관능기들을 화학적으로 반응시켜 실리카겔에 고정하여 중간 정도의 극성 및 역상으로 운영이 가능
Cf) 순상 : 고정상이 극성인 경우, 역상 : 고정상이 비극성인 경우
③ 알루미나 : 실라카겔과 같이 극성이며, 염기성 흡착제로 사용. 주로 염기성 화합물과 방향족 탄화수소의 분리에 사용
5. 이동상의 선택
① 정지상이 결정되고 나면 물질의 분리를 위해서 이동상(용매)의 선택과 용매의 세기 조절이 매우 중요
② 실리카겔을 이용한 순상의 경우 : 비극성용매인 n-헥산이 용매 강도가 약하고, 극성 용매인 물은 가장 높은 용매 강도를 가진다.
③ 역상 정지상인 경우 : 정지상이 비극성이므로 극성이 강한 용매를 사용. 이때 물이 용매강도가 약한 이동상
④ TLC 용매 조건 : 정지상과 반응하지 않아야 하고, 전개 후 쉽게 휘발로 제거가 가능해야 하고, 용매조합이 잘 섞여야 하고, 점도가 낮고 독성이 없어야 한다.
6. 점적 및 전개
① 고정상을 손상시키지 않고, 용출력이 작은 용매를 사용하여 가능한 한 작은 크기로 점적
② 시료를 점적한 후 용매를 완전히 제거하고 전개
③ 전개에는 구유형 전개조를 이용하는 수직전개, 양측에서 동시에 전개하는 수평전개, 아주 작은 증기층이 있는 샌드위치 시스템 등이 사용
④ 압력이 주어진 상태에서 전개하는 TLC/HPTLC 전개는 전개시간이 매우 짧다는 장점
7. 검출
① 물리적 방법 : 색깔을 통해 확인
② 화학반응을 이요한 방법 : 유도체화 반응을 통해 시료를 색 또는 형광을 내거나 자외선을 흡수하는 화합물로 변화시켜 검출하는 방법. 전개전 유도체화는 분석의 선택성을 향상시키거나 불안정한 물질을 안정화시킬 때 주로 사용하고 전개 후 유도체화는 가시화하거나 분석감도를 높이기 위해 사용함.
③ 생물학적 방법 : 항생제의 활성 효소 반응 등과 같은 생물학적인 방법을 이용하여 분석대상물질을 검출한다. 매우 예민한 방법이다.
8. 정성분석
① TLC결과 : Rf값 또는 머무름 지수 → 정성지표로 활용
② 값 : 시료의 이동한 정도를 용매의 이동거리 또는 표준시료의 이동거리를 기준으로 상대적인 값으로 표현
③ Rf = b/a (a : 용매선단의 이동거리, b : 물질의 이동거리)
9. 정량분석
① Densitometer를 이용하여 TLC plate의 분석물질 spot의 광의 흡수 또는 형광을 측정함으로써 정량화 한다.
② 흡수측정 : 물질에 의해 흡수된 후 반사된 빛의 양을 측정
③ 형광측정 : 물질에 의해 방출된 더 긴 파장의 형광 복사선을 광전자증배관에서 측정, 흡수측정보다 선택성과 감도가 더 높은 검출 방법
④ 검량선(검량식) 작성 : 직선의 검량식은 극히 제한된 검량범위에 사용, 예상되는 농도는 반드시 검량선의 중간 범위에 있어야 함
얇은 막 크로마토그래피(TLC) 원리
고체·액체 흡착크로마토그래피의 한 가지 형태로서 흡착제인 실리카겔 혹은 알루미나를 유리판 위에 얇게 입힌 고정상 판에 용매를 이동상으로 하여 전개할 때, 고정상과 이동상에 대한 시료 성분의 분배 정도 차이를 이용하여 분리하는 방법이다. TLC는 소량의 유기화합물의 혼합물을 신속히 분리, 확인하는데 사용되는 중요한 기술로써 액체(이동상)에 혼합물을 녹여 이동시키면 움직이지 않는 고체(고정상)에 흡착되는 정도가 각 성분마다 다르기 때문에 물질이 분리된다.
TLC는 매우 손쉽고 빠르게 할 수 있어서 TLC는 액체(이동상)에 혼합물을 녹여 이동시키면 움직이지 않는 고체(고정상)에 흡착되는 정도가 각 성분마다 다르기 때문에 물질이 분리된다. TLC는 소량의 유기화합물의 혼합물을 신속히 분리하고 확인하는데 사용되는데, 이는 서로 다른 성분이 이동상과 고정상에 흡착되는 정도나 이동하는 속도가 각 성분마다 다른 점을 이용하여 성분들을 분리해내는 원리이다. 박층 크로마토 그래피의 장점으로는 전개시간이 짧은 것과 분리능이 좋은 점, 여러 가지 지지체를 이용할 수 있어 이용범위가 넓고 회수도 쉬운 것, 강한 산, 강한 염기나 강렬한 시약등을 발생시약으로 사용할 수 있는 특징을 들 수 있다.
실험 요약
복잡한 혼합물을 분리하고 그 각각의 성분을 단리하는 것은 유기화학의 모든 분야에서 매우 비중이 있고 중요하다. 이런 상황에서 화합물을 분리, 분석 할 때 사용하는 기구중 하나를 크로마토그래피라고 한다. 크로마토그래피는 이동상과 고정상, 그리고 분리의 원리에 따라 분류하게 된다.
이중에서 박층크로마토그래피(TLC)는 최근에 발전한 수단이며, 정성분석 및 소규모의 분취에 널리 사용되고 있다. TLC는 다른 크로마토그래피에 비하여 혼합물 중의 성분의 분리가 좋고 빠르고 신속하게 행할 수 있는 조작으로 장점을 가지고 있다. 따라서 최근 유리나 플라스틱 판위에 실리카와 같은 고정상을 얇게 도포시킨 후 미량의 시료를 전개용매를 이용하여 분리, 분석하는 가장 많이 이용하고 있는 방법이다.
플라스틱이나 유리로 만들어진 TLC판에 사용되는 흡착제(고정상)로는 일반적으로 실리카겔(silica gel)이나 알루미나(alumina)등을 사용하며 강도를 증가시키기 위하여 소량의 황산칼슘을 함유하고 있기도 한다. 또한 흡착제에 자외선 254 또는 365 ㎚에서 형광을 띠는 물질을 소량 넣어서 자외선을 흡수하는 물질의 경우를 알아보게 만들 수 있다.
일반적으로 두께는 분석에 사용할 때의 0.25㎜부터 분취조제에 사용 할 때의 1㎜에 이르기까지 다양하다. 판의 크기는 20×20㎠ 크기의 제품이 주로 사용되지만 현미경용의 슬라이드글라스 25×75㎜ 크기도 사용하기도 한다. TLC를 사용하여 분리, 분석하는 방법은 다음과 같다. 먼저 TLC분석을 위한 시료는 시료가 잘 녹는 휘발성이 있는 용매(ethyl acete, ether, methanol 등)를 녹여서 용액으로 만든다.
하지만 이때 DMSO, DMF 같은 용매는 TLC분석을 위한 용매로 적당하지 않다. 이 용액을 유리모세관에 적셔서 모세관 안의 용액이 TLC판 위에 스며나오게 찍어내는데 이때 너무 펴지지 않도록 모세관을 판위에 닿게 하는 시간을 조절해야 한다. 그리고 용매가 모두 증발하면 전개용매를 이용하여 물질들을 분리하는데 이때는 여러 가지 용매를 잘 혼합해 다양한 극성의 전개액을 준비해두고 낮은 것부터 높은 것까지 여러 가지의 전개액을 시도해 보는 것이 좋다. 왜냐하면 극성에 따라 각 성분이 이동하는 거리를 조절할 수 있기 때문이다. TLC를 전개할 때는 전개액이 바닥에 깔릴 정도로 들어있는 전개통을 이용한다. 전개통의 안은 전개액으로 포화되어 있어야 재현성이 좋아질 수 있다.
그러기 위해서는 거름종이를 사용하여 통안을 포화시키는 과정이 필요하다. 이때 특정한 고정상의 TLC판에서 물질들은 고유 성질을 보이는데 주어진 전개액에서 서로 다른 물질은 전개했을 때 서로 다른 높이까지 올라가는 것을 볼 수 있다. TLC판에서 화합물의 특성을 표현하기 위해 전개액이 올라간 높이를 기준으로 상대적인 물질의 올라간 높이를 알 수 있다.
Rf 값(물질이 올라간 높이)/(전개액이 올라간 높이)을 주로 사용하여 값을 표현한다. Rf을 계산하는 방법은 다음과 같다. 먼저 포화된 전개통에 시료를 올린 TLC판을 세워서 넣고 뚜껑을 닫고 전개액이 위로 올라가도록 한다. 거의 끝 아래까지 올라갔을 때 TLC판을 꺼내서 전개액이 올라간 높이를 재고 물질이 올라간 높이를 재면 된다. 이때 용매 증기가 해로울 수도 있기 때문에 후드 안에서 건조시켜야 한다.
TLC분석을 위한 전개용매로는 위에서 말한 것들이 있지만 전개용매의 극성이 높을수록 Rf값은 커지므로 분석하고자 하는 시료의 Rf값이 0.4～0.6에서 나타나도록 용매를 만들어줘야 한다. 흔히 hexane, ethyl acetate, ether 등을 혼합하여 사용하거나 methanol을 약간 섞어 사용한다. 시료의 극성이 매우 높은 경우에는 0.5% acetic acid/methanol, 5% isopropyl alcohol/chloroform 용액을 사용한다.
위에서 흡착제에 형광물질을 넣어서 자외선으로 확인하는 법을 설명했듯이 TLC판위에 전개된 각 시료의 성분을 파악하는 다른 방법은 요오드착색, anisaldehyde를 이용한 착색법 등이 있다. 이런 방법들을 이용하는 이유는 각 시료의 성분들이 우리 눈에 잘 보이지 않는 경우가 있기 때문이다. TLC는 반응을 조절하고 감지하는데 매우 중요하고 편리하게 사용된다. TLC분석을 이용하여 우리는 반응의 정도를 쉽게 알 수 있다. 본 실험에서는 TLC의 사용법을 익히고 방법을 확인하기 위해 감기약속에 들어있는 해열진통 성분을 알아내는 실험을 할 것이다.
실험 기구 및 시약
1. 실험 기구
1) TLC병, TLC판, TLC용 유리 모세관, TLC용 UV 램프
2) 핀셋, 연필, rotary evaporator, 막자사발, test tube
2. 실험 시약
1) 아스피린, 타이레놀, 부루펜, 슈다피드, 카페인, 액체 감기약, 헥세인, 에틸아세테이트
실험 방법
1. 실험 과정
1) 실험전 미리 유리모세관과 TLC판을 만들어 놓는다 분석할 고체물질들은 가루로 만들어서 에틸 아세테이트에 녹여서 유리 모세관으로 찍어서 TLC판에 도포한 뒤 말린다.
2) 액체 감기약은 감기약 10㎖와 에틸아세테이트 10㎖를 분별깔때기에 넣고 잘 흔들어 섞은뒤 기다렸다가 아래 물층을 버리고 나머지를 rotary evaporator에서 농축시켜 TLC판에 찍는다.
3) 시료를 도포할 때는 시료마다 동일한 양과 높이 선상에 있어야 하고 너무 과량을 찍어서는 안된다.
4) 모세관은 사용할 때 마다 새것을 사용하고 동일한 높이선상은 필기도구를 이용할 수 있는데 시료, 전개액사이의 반응을 따져 보고 전개를 방해해서는 안된다(보통 연필을 사용).
5) 에틸아세테이트와 헥세인을 8:2부터 2:8까지 다양한 비율로 준비한다.
6) 전개액은 전개병에 넣어서 포화가 된 상태로 미리 만들어 두고 포화가 되었다면 TLC판을 전개병에 넣고 전개용액이 올라가도록 하되, 전개액이 TLC판의 시료에 집적 닿지 않도록 양을 넣어야 한다.(시료 바로 아래쪽에 오도록 하여야 실험 시간이 단축된다)
7) 전개액이 TLC판의 끝보다 조금 아래 와있을 때 TLC판을 핀셋으로 꺼내 말리고, 육안으로 확인 가능한 경우 전개상황을 확인한다.
8) 본 실험에서는 육안으로 확인이 불가능하므로 UV 램프를 이용하여 확인하면 된다.
9) TLC판에 찍어두었던 시료가 전개액의 방향을 따라 전개되어 생긴 검은색 점들은 각각의 다른 물질임을 보이고 어떤 물질인지 예상할 수 있게 한다.
10) 전개병에서 꺼내자마자 최대한 빠르게 전개상황을 확인하여 각 점들의 위치를 표시하고 시료를 찍어두었던 높이선상으로 부터의 거리를 구한다.
11) 각 점의 높이를 전개액의 높이로 나누면 Rf값이 되고 이를 통해 시료를 구성하는 물질을 찾아낸다.
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