미생물실험 | Mini-Prep (Hybrid-Q Plasmid Rapid prep Kit)

 

 

 

Mini Prep

DNA-isolation에 있는 원리 중 하나로 Plasmid DNA분리에 사용되는 방법이며 많은 후보를 빠른 시간 내에 분석하는 방법이다. Prep은 Prepartion의 약자.DNA를 소량으로 추출한다는 의미. 주로 이용되는 Alkylation lysis(denaturation)법과 boiling method, Iithium method법이 있다.

 

DNA와 plasmid의 고유 형태구조 원리에 의한 분리 방법으로써 세포내에 DNA는 일반적인 double-helix의 형태를 가지는 반면 plasmid는 supercoiled형태를 가짐으로써 pH변화에 따라서도 plasmid의 형태와 구조가 크게 변하지 않아 순수한 plasmid만을 추출하는 구조적 기본원리에 의한 방법이다.

 

 

실험 방법

1. Mini-prep.

1) 3㎖ bacterial culture (DH5a T-vector OmPGRP)를 12000rpm에서 1분간 centrifuge (2㎖ e-tube에 1.6㎖씩 여러 번 나누어 cell down 시킨다.)

 

2) 상층액을 버리고, 250㎕의 S1 buffer (Resuspension buffer)를 넣어 pellet을 resuspend.

 

3) 250㎕의 S2 buffer (Lysis buffer)를 넣고 조심스럽게 4회 inverting. (lysis time을 5분 이상 하지 말 것, vortexing 하지 말 것)

 

4) 350㎕의 G3 buffer (Neutralization buffer)를 넣고 조심스럽게 4～6회 inverting

 

5) 12000rpm으로 10분간 centrifuge (실온)

 

6) 상층액을 column에 옮긴다.

 

7) 12000rpm에서 1분간 centrifuge. collection tube에 걸러진 용액은 버린다.

 

8) 500㎕의 AW buffer (Washing buffer)를 넣고 12000rpm에서 1분간 centrifuge.

 

9) 700㎕의 PW buffer (Washing buffer)를 넣고 12000rpm에서 1분간 centrifuge.

 

10) filter membrane을 말리기 위해 12000rpm에서 1분간 centrifuge.

 

11) column을 새 tube에 넣고, 40㎕의 EB (Elution buffer)를 넣고 상온에서 1분간 incubate 후 12000rpm에서 1분간 centrifuge.

 

12) Mini-prep 확인

 

2. digestion

1) Mini-prep한 plasmid의 확인을 위해 아래와 같은 조성을 1.5㎖ tube에 첨가한후, 37℃에서 1시간 동안 incubation한다.

 

 

2) 1% agarose gel에서 전기영동하여 mini-prep한 plasmid의 size가 정확한지 확인한다. (이 때, loading dye가 들어있지 않기 때문에, 반드시 DNA loading dye(6x)를 첨가한 후에, gel에 loading한다.)

 

 

 

 

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