생명과학실험 | RNA interference 기법을 이용한 유전자 발현 억제

 

 

 

TIP

 

 

1. 유전자의 기능을 연구하기 위한 가장 효과적인 방법인 유전자를 유전체(genome)로부터 제거한 뒤 관찰하는 것을 가능하게 하기 위해서 small interfering RNA를 이용하여 유전자의 발현을 억제시키는 방법을 배워본다.
2. 본 실험에서는 cell을 눈으로 볼 수 있도록 H2AX 단백질에 GFP 형광 단백질을 넣어주어 형광 단백질의 %를 이용하여 쉽게 관찰할 수 있도록 한다.

 

 

 

RNA interference

RNA가 이중나선 형태를 지니고 있을 때 나타나는 현상으로 이중나선 RNA가 mRNA를 분해하여 특정 유전자를 발현되지 못하게 하는 것을 의미한다. 즉, central dogma 를 일으키지 못하게 하는 것이다. 이중가닥 RNA는 다이서(Dicer)라는 단백질에 의해 인식되어 작은 이중가닥 RNA 조각들로 잘린다. 그리고 이 조각들은 RISC라는 단백질 복합체에 결합하게 되는데 그 후 한가닥이 떨어져 나가면서 복합체에는 작은 한 가닥 RNA 조각만 남게된다.

 

이때 단일 가닥은 Dicer나 RISC를 활성화하지 못하게 된다. antisense RNA만으로는 이와 같은 과정을 일으킬 수 없기 때문에 RISC 복합체에 남은 단일 가닥 RNA 조각은 자기의 염기서열과 상보적인 mRNA와 결합을 하여 mRNA를 RISC 로 유인하고, 마지막으로 RISC 복합체는 mRNA를 분해하여 유전정보가 발현되지 못하도록 하는 것이 RNA interference의 전체적인 mechanism이다. 이때 이중나선 RNA에는 small interfering RNA (siRNA)가 있고, siRNA는 이중가닥의 RNA가 Dicer에 의해 절단되어 생성되는 21에서 25nt 크기의 작은 RNA조각을 말한다.

 

다시말하면, RNA interference는 RNA가 다른 mRNA의 translation을 막거나 DNA가 transcription되는 것을 막는 것을 말하며 RNA가 다른 mRNA나 DNA에 상보적으로 결합해 있을 때 일어난다. RNA 간섭 현상은 virus와 transposon과 같은 parasitic nucleotide sequences로부터 세포를 보호하는 기능을 가지며 일반적인 유전자의 발현을 조절하는 기능을 한다. RNA interference를 일으키는 방법은 다음과 같다. 가장 먼저 siRNA expression vector를 가진 gene에 의해 만들어진 shRNA를 dicer가 자른다.

 

그 다음으로 dicer에 의해 잘린 가닥 중 한 가닥이 RISC protein과 결합하여 RISC를 만든다. 마지막으로 이 RISC가 RNA interference을 일으킨다. 이때 mRNA의 상보적인 염기서열과 맞을 경우 그곳에 결합하여 mRNA의 translation을 방해한다. 그러나 핵 속으로 들어갈 경우 상보적 염기서열의 DNA와 결합하여 DNA의 transcription을 방해한다.

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실험 방법

1. 1주차 실험

1) Comp cell 20λ를 2ng/λ vector DNA 5λ와 섞어준다.

 

2) Ice에서 5분간 incubation한다.

 

3) 42℃에서 heat shock을 준다.

 

4) Ice로 옮겨서 1분간 식혀준다.

 

5) LB media 700λ를 넣어주고, 20분 동안 37℃ shaking incubator에서 incubation한다.

 

6) 원심분리기로 5)에서 incubation한 배양액을 넣고 v=3000rpm에서 3분동안 돌려 cell을 다운 시켜준다.

 

7) 6)에서 원심분리기에 돌린 배양액의 supernatant를 200λ만 남기고 제거한다.

 

8) Pellet을 잘 풀어준 뒤 LA plate에 뿌리고 spender로 고르게 흡수시킨다.

 

9) 37℃ incubator에서 12～16시간 동안 incubation한다.

 

2. 2주차 실험

1) 0.1X Tris-EDTA (TE) 102.5λ, 2M CaCl₂ 12.5λ와 100ng/λ DNA 10λ를 부피가 큰 순서대로 microfuge tube에 넣어준다.

 

2) 2X HBS 125λ에 1)의 용액을 방울방울 떨어뜨려서 전부 넣어준다.(위 1)과 2)과정은 모두 오염을 막기 위해 clean bench에서 수행한다.)

 

3) 2)의 용액을 20분간 37℃에서 incubation 시켜준다.

 

4) Target cell에 mature 3)의 용액)을 넣어준다.

 

5) 4～5시간 후 media를 교체해 준다.

 

6) 48시간 후 형광 현미경을 이용하여 cell의 발광 여부를 관찰한다.

 

 

 

[생명과학실험]RNA interference 기법을 이용한 유전자 발현 억제 레포트