생화학개론 | 원심분리기

 

 

 

TIP

 

 

1. 개 요(분획원심법)
2. 기본 원리
3. 침강 속도(Sedimentation Velocity)
4. 원심분리기의 구조
5. 원심분리법 (centrifugation)
6. 원심분리 이론
7. 원심분리 방법
8. 밀도기울기 원심분리 고려사항
9. 원심분리기의 성능에 따른 분류
10. 원심분리기의 종류
11. 기타 원심분리 관련사항
12. 원심분리기 사용시 주의사항
13. 산업적 응용
14. 원심분리기의 올바른 관리 방법

 

 

 

분획원심법

세포는 몇 천 가지나 되는 서로 다른 종류의 단백질을 가지고 있다. 어떤 단백질의 성질, 아미노산 조성, 그리고 아미노산 배열이 결정되기 이전에 그 단백질은 순도가 높은 시료를 만드는 것이 필수적이다. 단백질을 분리하는 방법은, 단백질에 따라서 서로 다른 전하, 크기, 용해도와 같은 성질은 이용한다. 많은 단백질은, 다른 생체 분자와 결합하므로 그들의 결합특성에 의해서 분리할 수 있다.

 

단백질의 재료는 일반적으로 조직 또는 미생물 세포가 된다. 세포를 분쇄하고, 단백질은 조추출액(crude extract)이라고 부르는 용액에 유리시키지 않으면 안된다. 필요하면, 세포내 분획을 조제하거나 세포소기관을 순수하게 분리하기 위해서, 분획 원심법을 사용할 수 있다. 추출물 또는 세포소기관의 시료가 일단 준비되면, 단백질의 분리를 위해서 여러 가지 방법이 이용된다. 이온교환 크로마토그래피는 아미노산을 분리하는 것과 거의 같은 방법으로 서로 다른 하전을 가지고 있는 단백질을 분리하는데 사용한다. 그밖에 크로마토그래피는 크기, 결합친화성과 용해도가 서로 다른 점을 이용한다. 크로마토그래피 이외의 방법으로는 염, 산, 또는 고온을 이용한 단백질의 선택적침전법이 있다.

 

이전에는 순수하게 분리되지 않았던 새로운 단백질의 정제방법은 이미 확립된 방법과 상식적인 방법 모두에 의해서 이끌어진 것이다. 많은 경우에 단백질을 완전히 정제하는데는 몇 가지의 서로 다른 방법을 연속해서 사용하지 않으면 안된다. 방법의 선택은 어느 정도 경험적인 것이므로, 가장 효과적인 방법을 결정하기 전에, 많은 프로토콜을 시도해 보지 않으면 안 된다. 이러한 단백질을 위해서 개발된 정제법을 지침으로 사용함으로써 때때로 시행착오를 최소한 줄일 수 있다.

 

생물분리공정에서 고체-액체상의 분리의 첫 단계로 많은 경우 원심분리를 사용한다. 원심분리는 고체와 고체를 둘러싼 액체 간의 밀도차를 이용한다. 부유물이 있는 현탁액을 가만히 두면 밀집한 고체는 중력의 영향으로 서서히 가라앉게 되는데 이러한 과정이 침전(sedimentation)이다. 서서히 침전되는 것을 원심력을 이용하여 가속하는 과정을 원심분리(centrifugation)라 한다. 따라서 침전과 원심분리는 유사하다.

 

그리고 침전(sedimentation)에 비해 원심분리는 다음과 같은 장단점을 가지고 있다. 원심분리는 공정을 계속적으로 반복할 수 있고, 많은 양을 짧은 시간안에 처리할 수 있으며, 멸균상태에서 조업이 용이하다. 그러나 설치자본 및 유지비용이 많이 들며, 에너지 소모가 많고 슬러리(slurry) 형태의 농축 등이 문제점이 될 수 있다. 원심분리는 산업적으로 생물적 분리의 첫번째 단계로써 사용되어진다.

 

예를 들면 발효된 맥주로 부터 불용성 물질을 제거하는 단계에서 사용된다. 이 방법은 0.2㎖의 적은 양에서부터 수천 리터에 이르기까지 가능하고 속도와 온도차를 5%의 오차에서 조절할 수 있다. 원심분리는 세포내 소기관의 분리 또는 세포내 물질 분리에도 이용된다. 그러나 세포내의 분자들을 구별하여 정제하는 것은 세포와 생산물을 분리하는 것 보다 더 힘들다. 그래서 원심분리는 DNA 재조합기술의 발전과 함께 더욱 더 중요한 분리공정이 되어지고 있다.

 

또한 원심분리기는 회전속도의 정도 즉, 원심력의 세기정도에 따라 크게 고속원심분리기(High speed centrifuge)와 초고속 원심분리기(Ultracentrifuge)로 구분할 수 있다. 고속원심분리기는 시료 내에 존재하는 성분들을 밀도 차에 따라 침전, 분리하는 분석기기로서 세포나 미생물(세균, 바이러스, 박테리오파아지)의 균체수집, 세포기관(핵, 리보소옴, 미토콘드리아 등)의 분리추출, 발효배양액이나 화학반응 용액의 침전 분리 또는 용액의 청정 등을 목적으로 사용한다.

 

초고속 원심분리기는 고속원심분리기에서 분리하기 어려운 생체내의 DNA, RNA, 단백질 등을 더욱 강한 원심력을 이용하여 분리하는 기기이다. 초고속 원심분리기의 일종인 XL-100K model의 경우 최고 100,000rpm의 회전력으로 694,000g의 원심력을 생성시킬 수 있다.

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기본 원리

시료 내에는 다양한 밀도의 입자들이 존재한다. 고속의 회전에 의해 발생하는 원심력의 작용을 받게되면 원심력에 비례하는 속도로 밀도가 큰 입자는 빠르게 침강하고, 밀도가 작은 입자는 느리게 침강하여 분리관내에서의 이동거리에 차이가 생긴다. 입자의 침강속도는 시료의 점도, 물리적 특성 등에 의해 결정되지만 다른 조건이 일치할 때에는 시료 입자의 크기(혹은 분자량) 및 용액의 밀도와 입자밀도의 차이에 비례하여 침강속도가 달라진다.

물체가 원운동을 하면 관성의 원리에 의해 원의 중심방향에서 원 바깥 방향으로 나가려는 힘이 원심력이다. 원심력의 크기는 질량×반지름×각속도의 제곱이므로 각속도를 조절하면 원심력의 크기를 조절할 수 있다. 원심분리기는 원심력의 크기를 조절하여 물질간의 상대적 밀도차를 조절한다.

 

원심분리기에서 각속도는 분당 몇 바퀴 회전하는 가를 나타내는 단위인 rpm이라는 단위로 표기된다. 원심분리되는 물체가 놓여지는 장소인 로터의 위치에 따라 원심분리되는 물질의 회전 반지름이 달라지므로 rpm대신 각속도와 회전반지름을 고려한 G라는 단위가 주로 사용 된다 (1G는 중력과 같은 힘으로써 10G는 중력 10배의 힘에 해당한다.) 실제로 원심분리에 이용되는 힘을 계산할 때는 반지름과 각속도, 원심분리되는 대상물질의 질량 이외에 물질의 점도, 밀도, 반지름, 부력이 함께 계산된다. 원심분리의 방법은 크게 두 가지로 나누어진다.

 

 

그 결과 시료 내 성분들은 각 입자의 밀도 차에 의해 층을 형성하게 된다. 원심분리는 분리방법에 따라 크게 두 가지 종류로 나뉘어지는데 differential centrifugation pelleting은 원심분리 후 상징액과 침전으로 시료가 분리되고, density gradient centrifugation은 밀도 경사가 있는 매질에서 시료를 원심 분리하는 방법으로 입자성분이 부분적으로 혹은 완전히 분리되는 것이 특징이다.

 

 

 

 

[생화학]원심분리기 레포트