뼈 조직의 해부학적 관찰을 통하여 osteoclast(조골세포)의 분화에 대하여 이해해 보자.
Osteoblast(조골세포) & Osteoclast(파골세포)
뼈의 성장, 유지, 그리고 보수를 위해 중요한 두 가지 bone cell이 있다. 첫 번째는 osteoblast이다. Osteoblast는 단핵 세포로써 뼈를 형성하며 extracellular organic matrix과 Ca2+(PO4)2을 분비하여 결정화를 촉진시킨다. 즉, 척추동물의 경을 만드는 세포로서 세포 밖으로 골질을 분비하고 스스로는 골질에 싸여 골세포로 변한다. 섬유모세포에서 분화한 것으로 분열능력이 크다. 그러나 노화된 뼈에서는 그 수가 감소한다.
두 번째는 osteoclast이다. 파골세포로써 골성분을 파괴하며, 골의 재흡수와 밀접하게 관련이 있다. 즉, Osteoclast는 매우 큰 부피를 가진 다핵 세포로 bone resorption을 수행한다. 이때 부가적으로 osteocyte라는 bone cell이 있는데 이 세포는 뼈로 가둬진 osteoblast로써 점점 퇴적되어 뼈가 된다. 이 osteoblast와 osteoclast는 모두 bone marrow에서 만들어진 것이다. Osteoblast는 stromal cell에서 분화되었으며, osteoclast는 white blood cell의 일종인 macrophage로부터 분화된 것이다. 이때 osteoblast와 그 i㎜ature precursor들은 RANK ligand와 osteoprotegerin이라는 화학 신호를 분비하여 osteoclast의 성장과 활성을 조절한다.
실험 방법
1. 실험 과정
1) 얇은 1㎖ 주사기에 α-MEM을 넣어 fluxing한다.
2) fluxing하여 떨어진 cell들을 50㎖ tube에 넣는다.
3) 50㎖ tube의 cell을 down시키기 위해 1500rpm에 3min동안 centrifuge시킨다.
4) Down된 cell만 Gey’s solution : PBS=3:1의 비율로 섞은 용액으로 resuspension해준다. (RT에서 2～3min 가만히 놔두면 더 효과적으로 제거 가능하다.)
5) 1500rpm에 3min동안 centrifuge시킨다.
6) down시킨 cell을 resuspension해준다.
7) Muscle, fur등 쓸데없는 것들을 거르기 위해 cell strainer로 50㎖ tube에 걸러준다.
8) 50㎖ tube의 media를 100π dish에 옮겨 담은 뒤 37℃ CO2 incubator에 넣어 over night으로 키운다.
9) 100π dish에 뜬 cell만 걷어낸다.
10) 걷어낸 cell을 1500rpm에 3min동안 centrifuge시킨다.
11) down시킨 cell을 100π dish에 3개로 나눠 split한다.
12) M-CSF를 넣어 3일간 배양한다.
13) 배양 후 100π dish의 바닥에 붙어 자라고 있는 cell들만을 scraper을 이용하여 긁어 모은다.
14) 1500rpm에 3min동안 centrifuge시킨다.
15) Cell이 down되면 resuspension을 해서 10λ 만큼 딴다.
16) Hemocytometer를 이용하여 cell을 counting 해준다.
17) 48 well plate의 한 well당 2×104개의 cell이 필요하므로 cell counting의 결과에 맞추어 (사용할 well 5개+1개) = 6개의 양 만큼 따서 50㎖ tube에 넣는다.
18) 총 용액 3㎖에 되도록 α-MEM을 넣어준다.
19) 30ng/㎕의 M-CSF을 30ng/㎖가 되도록 50㎖ tube에 넣는다.
20) 50㎖ tube의 용액을 한 well (0)에 500λ를 넣어준다.
21) 남은 50㎖ tube의 용액에 100ng/㎕의 RANKL을 100ng/㎖가 되도록 넣어준다.
22) 50㎖ tube의 용액을 4개의 well (1d, 2d, 3d, 4d)에 각각 500λ씩 넣어준다.
23) 각 날짜에 맞게 분화된 0, 1d, 2d, 3d, 4d의 well들을 각각 포름알데히드로 fixing해준다.
24) Fixing후 TRAP staining kit로 staining후 관찰한다.
[생명과학실험] Differentiation of Osteoclast 레포트
1. 실험 목적 1.1. 뼈 조직의 해부학적 관찰을 통하여 osteoclast(조골세포)의 분화에 대하여 이해해 보자. 2. 실험 이론 및 원리 2.1. 실험 배경 인간의 신체는 200개에 달하는 다양한 뼈로 구성되어 있다. 이 뼈들은 지지, 내부 중요 장기의 보호, 운동, 조혈 작용 등 다양한 기능을 가지고 있다. 위 기능은 신체를 유지하는데 필수적인 역할을 한다. 이러한 뼈는 시간이 감에 따라 인간이 건물의 낡고 오래된 부분을 지속적으로 보수해 나가듯
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