생명과학실험 | Antigen-antibody reaction을 통한 protein expression

 

 

 

TIP

 

 

Antigen-antibody reaction을 통하여 protein이 cell 내의 어느 곳에서 발현하는지 알아보자.

 

 

 

면역조직화학법의 원리

면역조직화학적 검사를 이용하여 검출하는 항원은 분자량이 5,000정도인 단백, 다당류, 핵산 등의 고분자 물질이다. 항원에는 항체를 식별하는 특정한 부위가 있는데, 이를 항원 결정부위 (epitope) 라고 부르며 분자량 5,000에 대하여 한군데가 있는 것으로 알려져 있다. 즉, 분자량 이 20,000이면 4개 정도의 항원 결정부위가 있다.

 

항원에 결합하는 항체는 혈청내의 면역글로블린 (Immunoglobulin, Ig) 이라 부르는 단백질에 존재한다. 면역조직화학에 이용되는 일차항체는 IgG 분자이며 항원과의 결합부위를 갖는 Fab(antigen binding fragment)라 불리는 짧은사슬과 Fc (crystallizable fragment) 라고 불리는 긴 사슬로 구성되어 있다.

 

일차항체(Primary Antibody)는 일반적으로 단일클론항체 (Monoclonal Antibody) 와 다 클론항체 (Polyclonal Antibody) 로 구분된다. 표지물질로는 Horse-Radish Peroxidase, Glucose Oxidase, Alkaline Phosphatase 등의 효소와 Fluorescein Isothiocyanate (FITC: 황녹색 형광), Tetrame-thylrhodamine isothiocyanate (TRITC: 적등색 형광) 와 같은 형광색소가 이용된다.

 

 

효소를 표지물질로 이용하는 방법은 형광색소나 방사성 동위원소에 비하여 여러 가지 장점을 갖고 있다. 즉, 효소의 반응이 반복되므로 민감성이 높고 방사성 동위원소와 같이 사용상의 규제와 특별한 시설을 필요로 하지 않으며, 형광물질이나 중금속은 형광현미경과 전자현미경적 검색에만 사용할 수 있지만 효소는 광학현미경과 전자현미경 모두를 사용할 수 있다.

 

양성반응을 관찰하기 위한 발색 과정은 부착시킨 효소의 종류에 따라 선택할 수 있다. 발색제는 Horse-Rradish Peroxidase를 부착시킨 검출계(detection system)를 이용한 경우 Diamino- benzidine(DAB), 3-amino-9-ethylcarbazole (AEC)를, Glucose Oxidase는 Tetrazoilum을 alkaline phosphatase는 BCIP/NBT, BCIP/INT, New fuchsin, Fast Red TR Salt 등을 사용 한다.

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실험 방법

1. 실험 과정

1) Mouse melanoma cell B16F10 1×10⁵ 개 seeding한 35mm dish를 준비한다.

 

2) Dish의 media을 제거한다.

 

3) Dish를 PBS 500㎕로 1회 wash한다.

 

4) Cell의 fixation을 위해 4% paraformaldehyde 500㎕를 넣고 r.t.에서 10분간 incubation한다.

 

5) Dish를 PBS 500㎕로 3회 wash한다.

 

6) Permeabilizing solution 500㎕를 넣고 15분간 incubation한다.(Permeabilizing solution = 0.2% Triton X-100 + 1% goat serum + 1X PBS)

 

7) Dish의 supernatant을 제거한다.

 

8) Primary antibody: anti-Sox10 (mouse): permeabilizing solution=1: 500으로 섞은 용액 500㎕를 넣고 r.t.에서 30분간 incubation한다.

 

9) Primary antibody: anti-Sox10 (mouse)는 재사용 가능 하므로 다시 원래의 tube로 옮긴 후 dish를 PBS 500㎕로 3회 wash한다.

 

10) Secondary antibody: anti-mouse Alexa 488 (green): permeabilizing solution=1: 400으로 섞은 용액 500㎕를 넣고 호일로 빛이 들어오지 않게 감싼 뒤 r.t.에서 30분간 incubation한다.

 

11) Secondary antibody: anti-mouse Alexa 488 (green)는 재사용 가능 하므로 다시 원래의 tube로 옮긴 후 dish를 PBS 500㎕로 3회 wash한다.

 

12) DAPI: PBS=1: 1000 으로 섞은 용액 500㎕를 넣고 r.t.에서 10분간 incubation하여 cell을 DAPI staining한다.

 

13) DAPI는 재사용 가능 하므로 다시 원래의 tube로 옮긴 후 dish를 PBS 500㎕로 3회 wash한다.

 

14) PBS를 1㎖넣고 현미경으로 관찰한다.

 

 

 

[생명과학실험] Antigen-antibody reaction을 통한 protein expression 레포트