기기분석실험 | HPLC를 사용한 과일 주스 속의 비타민 C의 분석

 

 

 

TIP

 

 

1. liquid chromatography를 익혀 미량의 원소도 아주 정확히 측정해 낼 수 있다.
2. HPLC의 이론 및 기기조작을 통하여 비타민 C의 성분을 분석하고 크로마토그래피의 원리를 이용하여 시료의 정량, 정성 분석 방법을 익힌다.

 

 

 

기체 크로마토그래피는 속도나 감도가 우수하므로 액체 크로마토그래피보다 널리 이용된다. 그러나 알고 있는 화합물의 85%는 기체 크로마토그래피법으로 분리하기에는 휘발성이나 안정성이 불충분하므로, 액체 크로마토그래피법이 널리 이용되는 잠재적인 가능성이 있다. 지금까지의 액체 크로마토그래피는 비교적 큰 지름의 컬럼을 써서 중력 또는 저압 펌프를 이용하여 작은 유속에서 사용되었다.

 

분리시간은 흔히 수 시간이 걸리고 모아진 많은 부분을 개별로 분석하지 않으면 안 되었다. 주로 기체 크로마토그래피법에서 발전된 크로마토그래피 이론이 고성능 액체 크로마토그래피(high-performance liquid chromatography) 장치와 기술의 발전을 가져왔다. 그 결과 분리와 정량을 분 단위로 할 수 있게 되었다.

 

 

Vitamin-C (Ascorbic Acid)

"항궤혈병 vitamin"이라 불리는 ascorbic acid는 1907년 Holst 와 Frolich가 동물의 궤혈병증상에 오렌지쥬스를 투여하여 치료시킨 후부터 연구가 본격화되었다. Vitamin-C는 흰색의 결정체로 구조적으로 단당류와 연결되어 있다. 자연계에는 환원형인 L-Ascorbic acid와 산화형인 Dehydroascorbic acid의 두 가지로 존재한다.

 

이 두물질은 서로 가역적이며 생리적 활성도 같다. Ascorbic acid는 건조한 상태에서는 안정하나, 습한 공기에서는 쉽게 산화된다.

 

 

산화작용은 열, 빛, 알카리성물질, 구리나 아연, 산화효소등에 의해 가속화된다. 때문에 ascorbic acid는 요리도중에 빼앗기는 경우가 많다. 가용성이므로 많은 량의 물과 같이 있을 때 버려지기 쉬우며, 신선한 과일이나 야채의 보관 중에도 손실될 수 있다. 동물의 조직에는 환원형의 ascorbic acid가 많으나 괴혈병 상태인 경우 산화형이 많아진다. 산화 - 화원의 가역적 특성은 ascorbic acid의 생화학적 반응에 기인하다.

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실험 방법

1. 실험 과정

1) 이동상용액(1.36g KE12POJL,증류한 탈이온수 사용) 3L제조

 

2) 1-자스코르브산 50㎎을 0.1㎎단위까지 정확히 무게를 달아 50㎖메스플라스크에 넣고 제조한 용액으로 묽힌다. 이 표준 용액은 0.1%용액이다. 이 용액을 묽혀 0.05%, 0.02% 표준용액도 만든다.

 

3) 펌프 Power ON

 

4) UV power ON.

 

5) 처음 2분간은 2.0㎖/min의 유속으로 이동상을 흘려보내 column을 flash시킨다.

 

6) 유속을 0.S㎖/min로 맞춘다. (이때, 0.1㎖/l 조절시 30초 간격을 두고 조절한다. )

 

7) Integrator ON

① 해당 년을 숫자로 넣은 뒤 enter key를 친다. (달, 날, 기간, 분도 동작업요)

② Is this a new file 이라고 나오면 1번을 누르고 enter key를 친다.(미리 설정된 값을 이용할 경우에는 0을 눌러 사용한다. )

③ 다음 사항이 기록지에 나온다.

 

 

④ CHART SPEED(SPEED KEY) 0.5에 맞춘다.

⑤ Speed key는 차트 진행속도를 1cm가는데 걸리는 시간이다.

⑥ Attenuation을 32로 맞춘다.

⑦ Attenuation이 작을수록 감도는 커진다.

⑧ MW(minimum width), MH(minimum height), MA(minimum area) key

⑨ MW, MH, MA의 입력값 보다 큰 peak를 peak로서 감지한다.

 

 

8) 제조한 표준용액을 10㎕ 주사기로 주입한다. Load상태에서 시료를 주입하고 Inject상태로 밸브를 돌리면 시료가 주입된다. 시료를 주사기로 주입시에는 기포가 없음을 확인해야한다.

 

9) 이때 머무름 시간과 Calibration Curve에 나타난 면적을 check하고 각 표준용액에 대해 이를 반복한다.

 

10) 준비한 미지시료(하이 C, 포도음료, 오렌지쥬스) 를 각각 주입한다.

① 머무름시간을 비교하여 비타민 C를 포함하는 쥬스를 확인한다. Calibration Curve면적을 보고 표준용액과 비교하여 미지시료(쥬스)내의 비타민 C의 농도를 결정한다.

 

11) 실험을 마쳤으면 integrator, detector, pump 순으로 전원을 끄며 pump는 서서히 유량을 0까지 내린다.

 

 

 

 

 

[기기분석실험]HPLC를 사용한 과일 주스 속의 비타민 C의 분석 레포트