일반생물학실험 | 세포 사멸 관찰

 

 

 

TIP

 

 

1. 세포의 죽음을 초래하는 두 가지 기전의 차이점을 비교한다.
2. 세포 사멸에 따르는 세포막의 변화를 관찰한다.
3. 세포 사멸에 따르는 핵의 변화를 관찰한다.

 

 

 

프로그램 된 세포 사멸(programmed cell death, apoptosis)

세포 수와 조직의 크기를 조절하며 생체의 발생 및 항상성 유지에 필요한 과정으로 세포 분열 만큼 중요하며 활발한 분자적 작용기적이 수반된다.

 

핵 내에 존재하는 크로마틴이 응축되어 핵막에 늘어선 뒤 핵의 붕괴와 더불어 세포 표면이 돌출되어 세포막에 둘러싸여 떨어져 나와 세포 사멸체(apoptotic body)를 형성한다. 이러한 apoptotic body는 대식세포에 의해 제거된다.

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실험 방법

1. Cell seeding과 세포사멸 유도

1) HEK293T 세포가 배양된 100mm dish에서 배지를 제거하고 PBS로 세척한다.

 

2) Trypsin-EDTA 1 ㎖을 dish에 넣고 세포에 고루 닿도록 10～20초 동안 흔들어준다.

 

3) Trypsin-EDTA 가 들어있는 dish에 DMEM 9㎖을 넣고 세포를 다시 혼합하여 50㎖ tube에 옮긴다.

 

4) 상온에서 3분 동안 1,000rpm으로 원심분리하여 세포를 회수한다. ③번 과정에서 일부를 덜어내어 세포 현탁액과 trypan blue를 1:1로 섞어 살아있는 세포를 계수한다.

 

5) 회수한 세포는 2 × cell/㎖ 이 되도록 DMEM을 넣어 혼합하고 coverslip이 놓인 35mm dish 에 cell을 깔아준다.(cell seeding)

 

6) DMEM(control), 2μM staurosporine, 0.5mM H₂O₂를 seeding된 세포에 처리하여 37℃ incubator에서 5% CO₂하에 각각, 8시간, 5시간 배양한다.

 

2. Wright-Giemsa 염색

1) 각 dish에 methanol-acetic acid(3:1)용액을 1㎖을 넣고 5분동안 방치한다.

 

2) 99%Methyl alcohol로 2분동안 고정시킨다.

 

3) Wright-Giemsa용액으로 15분 동안 염색한다.

 

4) Wright-Giemsa stain buffer 용액으로 5분 동안 염색한 후 PBS로 세척한다.

 

5) 50% glycerol을 처리한 후 현미경 관찰한다.

 

3. DNA fragmentation(laddering) 확인

1) 세포를 PBS로 collectin하여 e-tube에 옮겨서 1600 rpm 하에 5분 동안 원심분리한다.

 

2) Cell pellet에 400㎕의 hypotonic lysis buffer 를 넣어 섞어 주고 ice에서 10분 동안 반응시킨다.

 

3) 13,000rpm에서 10분 동안 원심 분리한다.

 

4) 상층 액을 새로운 e-tube로 옮겨서 400㎕의 isopropanol과 40㎕의 5M NaCl을 넣고 -20℃에서 DNA를 침전시킨다.

 

5) 13,000rpm에서 10분 동안 원심 분리한다.

 

6) DNA pellet에 70%EtOH 400㎕를 넣어 DNA를 세척하고 13,000rpm에서 5분 동안 원심분리한다.

 

7) DNA pellet을 건조시킨 후 증류수 20㎕를 넣어 DNA를 용해한다.

 

8) RNase를 넣고 37℃에서 30분 동안 반응시킨다.

 

9) DNA loading dye를 넣어 1% agarose gel 상에서 전기영동 하여 분리한다.

 

 

 

[일반생물학실험]세포 사멸 관찰 레포트