생명과학실험 | Alexa 594(Tuj1)의 neural tube(신경관)에서의 발현

 

 

 

TIP

 

 

1. 항원-항체반응을 통해 내가 원하는 단백질이 어느 세포에서 나오는지, 어느 정도 얼마큼 나오는지 알아 볼 수 있다.
2. antigen-antibody reaction을 이용하여 Alexa 594(Tuj1)이 neural tube(신경관)의 어느 곳에서 발현하는지 알아보자.

 

 

 

면역조직화학법의 종류

면역조직화학적 검사방법은 직접법 (Direct Method) 과 간접법 (Indirect Method)으로 크게 구분할 수 있으며, 간접법은 표지물질을 결합시킨 항체를 사용하는 표지 항체법 (Lable Conjugate Antibody Method)과 비표지 항체법 (Unlabelled Antibody Method)으로 구분된다.

 

간접법 가운데 가장 간단한 표지항체법은 일차항체에는 효소를 부착하지 않고 일차항체의 Fc부분에 특성을 갖는 이차항체에 효소를 부착하여 사용하는 방법이다. 이때 일차항체를 제조하는 동물과 이차항체를 제조하는 동물은 달라야 한다. 비표지항체법은 일차 혹은 이차항체에 표지물질을 부착시키지 않는 방법으로서 민감성이 매우 높은 방법이다. 여기에 해당되는 검사방법은 PAP법, ABC법 그리고, Protein A 법 등이 있다.

 

 

일반적으로 직접법은 비교적 간편하고 여러 단계를 거치는 간접법에 비해 비 특이적인 염색소견이나 Background Staining이 적다. 그러나 각각의 항체마다 효소를 부착해야 되는 어려움이 있다.

 

이에 비하여 간접법은 각각의 항원에 대한 일차항체를 제조한 동물이 동일한 경우에는 이차항체를 공통적으로 사용할 수 있고, 여러 과정을 거침으로서 반응의 강도를 증가시킬 수 있다. 간접법은 시간이 많이 소요되고 검사과정이 복잡하며, 비특이적 반응이나 배경이 염색되는 단점이 있었으나 최근 들어 자동 및 반자동 염색기의 개발과 시약의 개발 등으로 시간이 단축되었고 비 특이적인 염색이 줄어들었다.

 

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실험 방법

1. 실험 과정

1) Dissect embryo

 

2) Fix in 4% paraformaldehyde in PBS 2hr (RT) to overnight (4℃)

 

3) Sinking in 30% sucrose in PBS

 

4) Embedding in OCT compound

 

5) -80℃ stored

 

6) Sections are collected on Superfrost/Plus slides from Fisher

 

7) Wash the sample slides with 200㎕ PBS : 3min. × 2 times at r.t.

 

8) Add permeabilizing solution 200㎕ : 30min. incubation at r.t.(Permeabilizing solution=0.1% Triton X-100+1% goat serum+1X PBS)

 

9) Add primary antibody 200㎕ : 40min. incubation at r.t. (1:400)

 

10) Wash the sample slides with 200㎕ PBS : 3min. × 2 times at r.t.

 

11) Add secondary antibody: anti-mouse Alexa594 200 : 40min. incubation at r.t. (1:300)

 

12) Wash the sample slides with 200㎕ PBS : 3min. × 2 times at r.t.

 

13) DAPI staining : 200 10min, incubation at r.t. (1:1000)

 

14) Wash the sample slides with 200㎕ PBS : 3min. × 2 times at r.t.

 

15) Mounting with 30% glycerol 200㎕

 

 

 

[생명과학실험] Alexa 594(Tuj1)의 neural tube(신경관)에서의 발현 레포트