유전공학실험 | PCR과 Transformation

 

 

 

TIP

 

 

유전자를 cloning하여 vector에 주입하여본다. 그리고, 대장균에 주입하여 발현 정도를 관찰한다.

 

 

 

PCR

DNA의 원하는 부분을 복제·증폭시키는 분자생물학적인 기술이다. 이 기술은 사람의 게놈과 같은 매우 복잡하며 양이 지극히 미량인 DNA 용액에서 연구자가 원하는 특정 DNA 단편만을 선택적으로 증폭시킬 수 있다. 또한 증폭에 필요한 시간이 2시간 정도로 짧으며, 실험 과정이 단순하고, 전자동 기계로 증폭할 수 있기 때문에, PCR과 여기서 파생한 여러가지 기술은 분자생물학, 의료, 범죄 수사, 생물의 분류 등 DNA를 취급하는 작업 전반에서 지극히 중요한 역할을 담당하고 있다. 1970년대에 gene cloning기술의 개발은 이전에 불가능했던 방법으로 유전자와 유전자 활성에 대한 연구를 가능하게 함으로써 신선한 자극으로 받아들여졌다.

 

1984년에 캐리 멀리스(Kary Mullis)가 특정 DNA 서열을 증폭하기 위한 방법을 고안하여 중합 효소 연쇄 반응(Polymerase Chain Reaction)이라고 불렀다. 1985년에 중합 효소를 클레나우 중합 효소(Klenow polymerase)로 사용하는 PCR이 처음 공식적으로 발표됐다. 클레나우 중합 효소는 열에 약했기 때문에 매 주기마다 효소를 새로 넣어 주어야 했고 생성물의 최대 길이는 400bp에 불과했다. 1988년에 DNA 중합 효소로 Thermophilus aquaticus라는 미생물의 DNA 중합 효소인 Taq를 사용한 논문이 발행되었다. 열에 강한 이 중합 효소는 PCR의 효율을 월등히 끌어올렸다. PCR에는 일련의 세 개의 단계가 있고 30～40회 정도 반복된다. PCR의 첫 번째 단계는 DNA를 변성(Denaturation)시키는 것이다.

 

두 가닥의 DNA는 가열함으로써 분리시킬 수 있다. 분리된 각각의 DNA는 주형(Template)으로서 역할을 하게 된다. 변성 온도는 DNA 내에 있는 G+C의 양과 길이에 따라 달라진다. PCR의 두 번째 단계는 결합(Annealing)이다. 이 단계에서는 시발체(Primer)들이 주형 DNA에 결합을 하게 된다. 결합(Annealing) 온도는 반응의 정확성을 결정하는 중요한 요소인데 만약 온도를 너무 높게 하면 시발체가 주형 DNA에 너무 약하게 결합되어서 증폭된 DNA의 산물이 매우 적어진다. 또 만약 온도를 너무 낮게 하면 시발체가 비특이적으로 결합하기 때문에 원하지 않는 DNA가 증폭될 수 있다. PCR의 세 번째 단계는 신장(Elongation)단계이다. 이 단계에서 열에 강한 DNA 중합 효소가 주형 DNA에서 새로운 DNA를 만들게 된다.

 

PCR은 DNA, RNA 그리고 단백질 수준의 PCR로 나뉠 수 있다. 보통 유전자를 얻는 실험을 할 경우, 그 유전자의 전체를 보려는 것이 아닌 유전자 안에서의 특정 유전자를 관찰하는 것이 목적이다. 하지만 DNA를 바로 PCR하게 되면 특정 유전자를 얻기 힘들고 진핵 생물의 경우, 비 발현 부위(인트론; Intron)가 같이 나오는 등 여러 가지 문제점이 있다.

 

그것을 해결하기 위해 특정 유전자에 시발체를 붙인 다음, PCR을 DNA수준이 아닌 RNA나 단백질 수준에서 하는 역전사-PCR(RT(Reverse Transcriptase)-PCR)이 있다. 요즘에는 반응의 결과를 극대화하기 위해 Taq 중합효소 뿐만 아니라 여러 회사들에서 독자적으로 개발한 복합효소를 사용하기도 한다. 이렇게 PCR method는 매우 간단한 기술이다. 다시 말해 DNA중합효소에 의해 DNA분자의 짧은 부위가 여러 번 복제되는 것이 전부이다. 평범한 실험처럼 보이지만 그것은 유전학적 연구와 생물학의 더 넓은 영역에서 많이 응용되고 있다.

 

 

Transformation(형질전환)

외부 DNA를 숙주 세포 내에 넣어주어, 세포가 원래의 성질과는 다른 새로운 유전 형질을 추가로 얻게 되는 것. E.coli는 선형 또는 원형DNA를 받아들일 수 있는데, 이러한 과정을 transformation이라 하며 다음과 같은 단계를 거쳐 이루어진다. E.coli cell이 DNA를 uptake할 수 있는 상태(competent)로 만들어 주기 위해 E.coli cell을 칼슘이온과 같은 multivalent ion의 존재 하에 0℃에서 incubation한다.

 

이 때 37℃～42℃로 heat shock을 가하면 E.coli membrane 내외의 thermal imbalance가 생겨 DNA가 세포 안으로 빨려 들어가게 된다. 이외에 electroporation에 의한 transformation으로 electric charge를 E.coli cell에 순간적으로 가하여 이때 생긴 pore을 통해 DNA를 세포 안으로 넣는 방법이 있다. Host cell로 들어간 DNA는 ampicillin 내성 유전자(Beta lactamase를 cording 하는 유전자)가 포함된 plasmid를 사용하여 ampicillin이 포함된 배지에서 선별해서 확인한다.

 

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실험 방법

1. 실험 과정

1) 형광 발현 유전자를 PCR로 cloning한다.

① 튜브에 DNA template 1㎕, FW primer 2㎕, RV primer 2㎕, DW 15㎕를 넣으려고 하였으나 실패의 가능성이 있으므로 각각 2배의 양으로 한다.

 

② 그 다음 polymerase, buffer들이 있는 PCR tube에 옮겨 담은 다음 잘 섞이도록 pipetting을 해준다. PCR tube에는 라벨링을 한다. → PCR tube 속에 있는 파란 물질은 염색을 하기 위한 용도로 전기영동 시에 홈에 주입하였는지 확인을 더 쉽게 할 수 있다.

 

③ 94℃에서 2분 동안 진행하고 94℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 1분 30초로 한 cycle을 설정하여 35cycle을 진행한다. 그런 후 4℃에서 보관한다. → cycle이나 온도, 시간의 설정은 충분히 primer가 붙을 수 있도록 설정한다.

 

④ 2㎕을 전기영동한다.

 

2) PCR산물을 분리, 정제한다.

① PCR산물의 볼륨의 5배에 해당하는 양의 buffer PB를 넣은 후에 준비된 column에 모두 옮겨 담고 30초 동안 원심분리 한다.

 

② 아래쪽에 필터링 된 물질을 pipette으로 제거한 후 buffer NW를 700㎕ 추가한 후에 30초 동안 원심분리 한다. 원심분리 후에는 필터링 된 물질을 제거한다.

 

③ 1분 동안 추가적으로 원심분리를 하고난 후에 새로운 1.5ml tube로 column을 옮긴다.

 

④ 30㎕의 buffer EB를 넣고 1분 동안 원심분리를 한다.

 

⑤ 1.5ml tube에 있는 물질이 정제된 PCR산물.

 

⑥ 2㎕을 전기영동한다.

 

3) 2X Rapid Ligation Buffer - 5 ㎕, pGEM®-T Easy Vector (50 ng) - 1 ㎕, PCR product - 3 ㎕, T4 DNA Ligase - 1 ㎕로 총 10㎕를 튜브에 넣고 이 튜브를 1시간 동안 실온에 보관한다.

 

4) 칼슘을 처리한 박테리아가 해동될 때 까지 얼음에 보관하고 이후 조심스럽게 세포를 반응 튜브 안으로 주입한다.

 

5) 튜브를 얼음에 30초 동안 보관한다,

 

6) 42℃의 물에 90초 동안 놔두었다가 이후 즉시 2분간 얼음에 다시 놔둔다. → 열처리 시에 벡터가 들어간다.

 

7)실온에서 SOC medium 800㎕에 반응한 산물을 넣고 37℃에서 45분 동안 인큐베이터에서 shaking한다.

 

8) 도말할 gel을 미리 만들어 plate에 부어 굳힌다.

 

9) transformation된 산물을 인큐베이터 안에서 plate에 도말하여 하루 밤이 지나면 관찰한다. → 실제 관찰은 실험이 끝난 후 5일 뒤 관찰.

 

 

 

 

[유전공학실험]PCR과 Transformation 레포트