분자생물학개론 | Reversed-Phase High-Performance Liquid Chromatography

TIP

 

 

1. Reversed-Phase High-Performance Liquid Chromatography
2. 이동상 조성에 따른 분류
3. RP-HPLC Materials
4. RP-HPLC Methods
5. RP-HPLC elution profile illustrating the purification of a synthetic peptide.
6. The Ligands
7. C18 Column
8. Free Silanol
9. Column Packing Geometry
10. Column Dimensions
11. The Ionic Additive
12. Mobile phase
13. Gradient Time and Shape
14. LC컬럼의 특성

 

 

 

이동상 조성에 따른 분류

1. Isocratic & Gradient elution

① Isocratic Mode(일정용매 조성법)

- 분석시간동안 용매의 조성이 바뀌지 않는다.

- 분석시간 동안 이동상 조성의 변화가 없다.

- 분석시간동안 용매의 조성이 일정한 것을 말한다.

 

 

즉 이동상이 60% ACN / 40% H20 인 경우 분석시간동안 이 조성을 유지하면서 분석이 진행되는 것이다.

isocratic elution은 간단하나, 늦게 용출하는 성분일수록 peak의 폭이 넓어지므로 빠른 용출성분과 매우 느리게 용출되는 성분이 공존하는 시료의 분석에는 적합하지 않다.

 

복잡한 화합물인 경우 여러 가지 컬럼을 교체하여 분석하여도 분석이 안 될 경우에는 분석시간동안 용매의 조성을 바꿀 수 있는 다른 모드, 즉 Gradient Mode를 사용해야 한다.

 

② Gradient Mode (구배용매 조성법 )

- 분석시간 동안 이동상 조성이 시간의 흐름에 따라 변한다.

- 분석동안 용매의 조성을 바꾸어 줄 수 있음

- 시간에 따른 변화 및 그 형태까지도 변화시킬 수 있다.

 

복잡한 화합물을 분리할 경우 사용하는 용매의 강도를 변화시킴으로써 분리도를 개선하고 분석시간을 단축할 수 있는데 이러한 방법을 Gradient Mode라 한다.

 

Gradient Mode는 두 가지로 나뉘어 질 수 있다.

1) Low Pressure Gradient Formers

Single pump, Helium sparging ,Degassing 반드시 해야 한다.

 

용매의 조성을 변화하기 위해 2개 내지 그 이상의 용매들을 섞는 mixer가 펌프 앞부분에 있으며 이때 용매는 low pressure상태에서 섞이게 된다.

 

이러한 형태는 1개의 High Pressure Pump를 사용하여 Gradient가 가능하며 값이 저렴하고 사용이 간편한 장점이 있지만 단점으로는 용매를 완전히 degassing시킨 뒤 사용해야 한다. 만약 bubble이 pump로 들어갈 경우 유량의 정밀도에 영향을 줄 수 있고 펌프도 치명적인 손상을 받을 수 있다.

 

 

2) High Pressure Gradient Formers

분석하는 동안 사용되는 용매가 각각의 다른 High Pressure Pump에 연결되어 있으며 컬럼 앞부분에 연결된 mixer에서, 즉 high pressure상태에서 용매는 섞이게 된다.

 

 

장점 - 각각 펌프의 outlet을 독립적으로 programming하여 컬럼으로 이동상이 들어가기 전 mixer에서 용매들을 섞어주므로 모든 형태의 gradient mode가 가능하다.

단점 - 별도의 gradient controller가 필요하므로 가격이 비싸다.

 

 

 

 

[분자생물학]Reversed-Phase High-Performance Liquid Chromatography 레포트