생리학실험 | 콜레스테롤 흡광도 검사

 

 

 

콜레스테롤(cholesterol)이라는 고리모양 구조가 생기는 데에는 squalene이라는 중간물질을 거치게 된다. squalene은 얼른 보아 직쇄상인 것 같지만 이것을 다시 표현하면 콜레스테롤(cholesterol)과 매우 비슷한 입체구조를 가지는 것을 알 수 있다. 콜레스테롤(cholesterol)은 acetyl-CoA로부터 합성될 수 잇지만 한편 다른 합성과정이 중간체로부터도 생길 수 있다.

 

예컨대 아미노산인 leucine은 그의 분해과정에서 hydroxymethylglutaryl-CoA가 생기게 되므로 elucine은 콜레스테롤(cholesterol)의 좋은 precursor라 할 수 있다. cholesterol분자의 모든 탄소는 acetyl-CoA로부터 유도될 수 있다. acetyl- CoA가 축합되어 acetoacetyl-CoA까지 되는 초기의 반응들은 지방산의 합성과정에서와 똑같다. 다만 여기에 관여하는 효소들은 세포질안에 존재하며 ACP단백질을 필요로 하지 않는다는 점이 서로 다르다.

 

이와 같이 합성된 acetoacetyl-CoA는 축합 반응과 환원 반응에 의하여 mevalonic으로 된다. 이때의 환원 반응에는 hydroxymethylglutaryl-CoA reductase라는 효소가 관여하며 cholesterol 합성과정에서의 율속 단계로 알려져 있다. 따라서 이 반응의 속도를 조절할 수 있는 어떤 방법이 알려진다고 하면 혈액중의 cholesterol수준을 조절할 수 있을 것이다.

 

합성된 mevalonic acid는 많은 ATP를 소비하여 미묘한 여러 반응을 거쳐 두 가지의 활성 isoprene 단위 (active isoprene unit)인 dimethylallyl pyrophosphate 은 반응성이 강하여 여러 형태의 축합 반응을 일으키며 steroid를 비롯하여 이른바 여러 가지 isoprenoid를 합성하게 된다. 콜레스테롤(cholesterol)은 동물체내에 존재하는 여러 가지 steroid류 예컨대 담즙산, 비타민 D, 호르몬 등을 합성하는데 모체가 된다.

 

steroid 호르몬은 몇 가지의 반응을 거쳐 다른 기능을 가지는 호르몬으로 바뀔 수 있다. 예컨대 임신에 필요한 호르몬인 progesterone은 3단계의 반응을 거쳐 남성 호르몬인 testosterone으로 변화될 수 있다. 동물조직에서 여러 가지 steroid 호르몬의 패턴이 서로 다른 것은 steroid상호간의 화학반응을 어떻게 조절하느냐에 달려 있는 것이다.

 

대부분의 콜레스테롤은 지방소화에 필요한 담즙산을 만드는데 사용되며 신체의 세포막, 세포의 미세 입자막, myelin sheath(수초) 등 세포의 구성성분을 이루며, 체내지질대사 이상의 지표로서 중요하다. 또 콜레스테롤은 내분비 기관에서는 steroid hormone 등의 합성에 사용되기도 한다. 이와 같이 콜레스테롤은 담즙산 및 성호르몬의 주요 구성성분이며 세포막을 형성하는 중요물질이기 때문에 너무 많거나 부족해도 안 된다

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실험 방법

1. 실험 과정

① 혈액을 상온에서 응고될때까지 기다린 후 냉장고에서 냉각

② 약 3000rpm 5min가 원심 분리

③ sup만 따로 모은다.

 

2. cholesterol standard curve 작성

표준용액(1mg/ml)	0.5	1.0	1.5	2.0	2.5
ethylacetate-etanol(ml)	4.5	4	3.5	3.0	2.5

섞어 3000rpm 5min 원심분리

1) sup. 0.5㎖ + FeCl₃ 1㎖ + H₂SO₄ 1㎖을 섞는다.

 

2) A₅₅₀에서 흡광도 측정

 

3) standard curve 작성

 

2. cholesterol 총량

1) 혈청 0.5㎖ + ethylacetate ethanol 5㎖를 섞는다.

 

2) 3000rpm, 5분 원심분리

 

3) sup. 0.5㎖ + FeCl₃ 1㎖ + H₂SO₄ 1㎖을 섞는다.

 

3. free cholesterol 양 측정

1) 나. 추출액 0.6㎖ + Tritonx-100 2㎖을 섞는다.

 

2) 10분간 상온에서 incubation

 

3) 3000rpm 5min centrifuge

 

4) pptf,f 1㎖ acetone 1회 washinl

 

5) acetone 완전히 제거후 ethylacetate 0.3㎖ + FeCl₃ 1㎖ + H₂SO₄ 1㎖을 섞는다.

 

6) A₅₅₀에서 흡광도 측정

 

7) 양 측정

 

 

 

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