미생물학실험 | 평판배양법을 이용한 구강미생물 배양

 

 

 

배지란 미생물이나 동식물의 조직을 배양하기 위하여 배양체가 필요로 하는 영양물질을 주성분으로 하는 것을 말한다. 기체상으로 얻어지는 것을 제외한 생존, 발육에 불가결한 물을 비롯하여 영양물질로서 탄소원, 질소원, 무기염류, 발육인자 등이 포함되어있다. 배지는 물리적 상태에 따라 고체배지와 액체배지로 구분한다. 고체배지는 액체배지에 한천, 젤라틴, 실리카겔 등 젤을 형성하는 물질을 첨가하여 제조한다. 고체배지는 목적에 따라 평판배지, 사면배지, 고층배지로 구분 할 수 있다.

 

본 실험에서는 평판배지를 이용하였으며 한천(agar)을 이용하여 고체의 형태로 만들었다. 한천(agar)은 홍조류에서 추출한 복합 다당류로 100℃에서 녹으므로 배양 시 고체 상태를 유지 할 수 있다. 일단 녹으면 45∼50℃까지 액체 상태를 유지하며 식어서 단단하고 투명한 젤(gel)을 형성하여 colony 관찰이 용이하다. 이번 실험에서는 약 일주일간 액체배지에 배양한 구강미생물들을 희석하여 고체 평판 배지에 배양하고 다음날 colony의 개수로 미생물의 수를 추정 한다.

 

 

실험 방법

1. 실험 과정

1) 실험에 앞서 소독용 에탄올로 손(장갑)과 주변을 소독한다.

2) 전자저울로 LB가루 4.5 g, Agar가루 2.7 g을 재서 삼각플라스크에 넣고 메스실린더를 이용해 증류수 180 ㎖를 측정하여 삼각플라스크에 넣고 잘 흔들어 준다.

3) 삼각플라스크의 입구를 은박지로 봉하고 120℃에서 30분 동안 Auto clave 한다.

4) Auto clave가 끝나고 삼각플라스크를 조금 식힌 후 Conical tube에 45 ㎖씩 4번 옮겨 담고 각각은 12개의 Petri-dish 에 15 ㎖ 씩 담아서 완전히 굳을 때 까지 식힌다.

5) 액체 배지에서 일주일간 배양한 구강 미생물을 마이크로피펫으로 1 ㎖를 취하여 증류수 9 ㎖에 넣어 10배 희석한다. 이 희석액을 또 마이크로피펫으로 1 ㎖를 취하여 증류수 9 ㎖에 넣어 희석한다. 같은 방법으로 총 5번 희석 해준다. 그러면 10∼10⁵ 배 까지의 희석액이 만들어 진다. 이 중 10⁴배 희석액과 10⁵배 희석액을 사용한다.(이 방법을 계단희석(serial dilution)이라고 한다.)

6) 마이크로피펫으로 희석액 0.1 ㎖를 취하여 고체 평판 배지위에 놓은 후 스프레더로 희석액이 스며들어 뻑뻑한 느낌이 날 때 까지 고르게 펴준다. 똑같은 방법으로 다른 희석액들 에도 미생물을 배양한다. 스프레더는 사용전에 에탄올에 적셔 소독하고 에탄올을 없애기 위해 알콜램프를 사용한다.

7) 미생물을 incubator에서 약 15시간 정도 배양한 후 colony의 개수를 측정한다.

 

 

 

 

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