Flow Cytometry의 발전 역사
1930년 스웨덴 Karolinska Institute의 Caspersson이 세포내 핵산과 단백질 양을 측정하기 위해 microspectrophotometer를 개발한 것이 가장 시초이다. 1947년 Northwestern대학(미국)의 Gucker등에 의해 공기를 빠른 속도로 주입하면서 검체를 실려 보내고 입자가 통과하면 빛이 산란되어 photodetector에서 전기 신호를 검출해낼 수 있는 최초의 Flow cytometer가 개발 되었다. 1950년 형광 항체가 개발되었으며 이즈음 hematology counter가 도입되기 시작하였다.
형광 측정이 cytometry에 도입된 것은 1960년대에 들어서서 DNA content 분석을 시도하고 부터였다. 1970년대에는 Herzenberg 들에 의해 fluorescence flow cytometry와 cell sorting법이 개발되어 살아있는 세포를 분리하여 연구에 사용할 수 있게 되었다. 현재는 초당 10만개의 세포를 분석할 수 있으며, 100만개중에 하나 섞여있는 드문 세포를 찾아낼 수 있고 1%이내의 정밀도로 형광을 측정하고, 세포 표면에 붙어 있는 수백개 분자의 형광 항체를 검출해 낼 수 있다.
Slow flow system에서는 관찰시간을 microsecond에서 millisecond로 늘림으로서 한 분자의 형광 분자의 검출이 가능해짐으로서 세균, 바이러스, macromolecule등의 연구에 이용될 수 있다. 또한 이들에 microfluidic technology가 도입됨으로써 flow를 정지시키거나 뒤로 돌릴 수 있게 되어 가능한 많은 각각의 cell의 정보를 알 수 있게 되었다.
Flow cytometry
염색체나 세포 수준의 작은 입자의 개수를 세거나 관찰하는 기술이다. 현미경으로 관찰해야 보이는 이런 입자들을 유체 속에 고정시켜 놓고 전기적 탐지 장치(electronic detection apparatus)를 거치게 하는 방식으로 관찰한다. 이 기술은 초당 수천에 달하는 입자의 물리, 화학적 성질을 한번에 다중-매개변수 분석으로 실행할 수 있게 한다. Flow cytometry는 혈액암과 같은 질병을 진단하는데 일상적으로 쓰이며, 임상 실험이나 연구 등에도 응용된다. 흔히 우리가 흥미를 갖는 입자들을 성질에 따라 분류하여 정제하는 등의 일에도 쓰여진다.
Flow cytometry의 원리
Flow cytometer(유세포 분석기)는 가느다란 관의 유체에 들어있는 미립자를 세고, 조사하거나 구분하는 기법이다. 이는 광학상의 혹은 전자적인 검출방법을 통해 각각의 세포의 물리적인, 화학적인 특징 등의 동시적인 여러 요소의 분석을 가능하게 한다. 유핵 상태의 입자나 세포가 흐름 상태에서 검출영역을 지날 때 핵 내의 DNA양의 분석이나 세포의 크기, 표면항원, 내부조성 등의 차이 또는 변화를 분석할 수 있다.
Flow Cytometer는 측정하고자 하는 세포집단의 세포들을 각각 하나씩 측정하여 분석하는 특징을 가진다. 유액상태의 입자나 세포를 감지하기 위해서는 일정 파장을 띄는 형광이 표시된 항체 같은 형광염색소의 표지가 필수적이며, 형광을 감지하는 방법으로는 광원인 레이저광원을 통한 형광의 발광작용을 이용한다
Flow cytometer는 주로 레이저광선인 빛의 단파장 광선이 hydro-dynamic하게 초점이 된 유체의 흐름으로 향한다. 여러 가지 검출기들이 유체의 흐름이 빛 광선을 통과하는 점을 측정하도록 되어 있다. 하나는 가시광선과 같은 방향으로 향하고 있으면 이를 Forward Scatter(FSC)라고 하며 나머지는 이에 수직으로 향하게 되어있는데 이들은 Side Scatter (SSC)와 하나 혹은 여러 개의 형광 검출기이다.
각각의 부유하는 입자들은 광선을 어떠한 방식으로든 산란시키게 되며 입자에 위치하거나 붙어있는 형광물질은 광원보다 낮은 주파수에서 빛을 방출하는 들뜬 상태가 된다. 이러한 산란되고 형광성의 빛의 조합이 검출기에 의해 검출이 되고 각 검출기에서의 밝음의 변이를 분석하여 각각의 입자의 물리적 화학적이 여러 가지 다양한 정보를 알 수 있다.
FSC는 세포의 부피와 연관되고 SSC는 핵의 모양, cytoplasmic granule의 양과 종류 또는 세포막의 거칠한 정도 등의 입자의 내부 복잡성에 의존한다. 어떤 flow cytometer는 형광물질을 이용하지 않고 빛의 산란된 정도만을 이용하기도 한다. 또 다른 flow cytometer는 각 세포의 형광성, 산란된 빛, 투과한 빛의 상을 형성하기도 한다. Flow cytometer는 크게 세 개의 중요한 부분으로 나누어 지는데 첫 번째는 검체의 처리(Fluidic system), 두 번째는 빛의 산란과 형광의 감지(Optical system), 마지막은 signal processing으로 데이터의 처리(electronic system) 과정으로 구성된다.
1. Fluidic system
세포나 입자를 일정한 감지지역(sensing point)까지 정확하게 운반하고, 운반되는 동안 어떠한 물리적인 영향도 받지 않도록 보호하는 역할을 한다. 유액은 특별히 Laminar Flow라는 형태로 진행이 된다. 유액 흡입시 흡입되어지는 관에서는 관의 중앙과 벽면에 압력이 가해져서 관의 중앙에서는 최고속도를, 관의 벽면은 최저속도를 만들어 포물선 형태의 유액이 만들어 진다. 유액은 관을 따라 내려가면서 안정된 포물선 형태를 유지하게 되고, 유액내의 입자는 관의 중앙에 위치하면서 Hydrodynamic Focusing이라 불리는 일정 감지지역까지 운반되어진다.
2. Optical system
Flow cytometer는 에너지원으로 빛(Light)을 이용한다. 분석할 입자나 세포들은 작고 일정 감지지역을 신속하게 지나가기 때문에 빛에는 강한 강도가 있어야 하고 형광염색소(Fluorescent dye)를 자극(Excitation)시키기 위한 특정한 파장(wavelength)을 가져야 한다. Flow cytometer에서 이용되는 에너지원은 주로 Laser이다. Laser Beam을 통과한 입자들은 빛의 산란정도에 따라 몇 가지 Parameter들로 나뉜다. 즉, Laser Beam 축에서 1 - 10°각도로 산란되는 빛은 정면에서, 그 이상의 각도로 산란되는 빛은 90°방향에서 렌즈를 두어 빛을 모은다.
1) Parameter
① Forward Scatter(FSC) – 입자의 크기
② Side Scatter(SSC) – 입자의 과립, 형태
③ Fluoresent(FL) – 형광강도
Optical filtration의 목적은 염색된 입자로부터 섞여 있는 여러 특징들을 갖는 Parameter를 분리하는데 있으며, 이를 위해 여러 가지 Absorption filter가 이용된다. 이러한 filter를 이용하여 한 곳에서 중첩되는 여러 파장을 분리한다.
2) Absorption filter
① LongPass filter – 지정된 파장보다 긴 파장 흡수
② ShortPass fiter – 지정된 파장보다 짧은 파장 흡수
③ BandPass fiter – 지정된 파장범위 내ㅇ 파장만 흡수
3. electronic system
Photodetector에 빛이 도착하면 그 전류에 의해 pulse가 생성된다. 이 pulse의 진폭은 photodetector에 도착하는 photon의 수에 비례하며, pulse의 모양은 입자의 크기와 속도, beam에 비춰지는 입자의 너비, 형광색소의 종류, 입자 내에 존재하는 형광염색소에 따라 결정된다. Digital conversion이 장착되어 pulse로부터 발생하는 신호를 컴퓨터로 분석하기 위해 모두 수치화하는 역할을 한다.
Flow cytometry의 응용
Flow cytometer는 분자생물학, 병리학, 면역학, 식물생물학, 해양 생물학 등의 다양한 영역에 이용이 된다. 분자생물학에서는 특히 형광물질로 태그된 항체를 이용할 경우에 더욱 유용해진다. 이러한 특정한 항체들은 target cell의 항원에 붙어서 연구되고 있는 세포의 여러 가지 특징들에 대한 정보를 알 수 있게 해준다. 해양생물학에서는 광합성 플랑크톤의 자가 형광성의 특성이 Flow cytometer에 이용되어 그 수와 집단의 구조를 알 수 있게 해준다.
단백질 공학에서는 이스트나 박테리아 등의 표지와 함께 쓰여 원하는 특성을 갖는 다양한 세포 표면의 단백질을 알 수 있도록 해준다. 의학에서 광범위하게 이용이 되고 있는데 특히 이식, 혈액학, 종양면역학, 화학요법, 유전학 등에 주로 이용된다. 연구소에서 많이 사용하던 Flow cytometer가 임상적 검사에 사용되어진 것은 몇 년이 안 된다. 진단검사학적으로는 혈액학적인 cell counter 그 적용 범위는 다양하다. 임상적으로는 림프구 특성 분석, Lymphocyte leukemia와 lymphoma의 성상규명, DNA content 분석, 혈소판 연구 및 각종 면역질환의 진단 및 병인 연구에 널리 사용되며 면역학, 세포생물학 및 발생학 분야 등에서 매우 광범위하게 이용되고 있다.
[분자생물학]Flow cytometer(FACS)의 원리 및 응용 레포트
1. Flow Cytometry의 발전 역사 1930년 스웨덴 Karolinska Institute의 Caspersson이 세포내 핵산과 단백질 양을 측정하기 위해 microspectrophotometer를 개발한 것이 가장 시초이다. 1947년 Northwestern대학(미국)의 Gucker등에 의해 공기를 빠른 속도로 주입하면서 검체를 실려 보내고 입자가 통과하면 빛이 산란되어 photodetector에서 전기 신호를 검출해낼 수 있는 최초의 Flow
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