1. Plasmid DNA
2. Plasmid DNA 분리
3. RNA is structurally very similar to DNA. How can you remove RNA during plasmid isolation?
4. How do you break the cell membranes?
5. What is the role of ethanol in the current experiment?
6. How do you determine the concentration of the plasmid isolated using UV/Vis spectrometry?
7. 실험 기구 및 시약
8. 실험 방법
Plasmid DNA
염색체 밖에 존재하는 DNA이다. plasmid DNA는 그 자체 내에 replication origin을 가지고 있어서 박테리아 내에서 염색체 DNA복제와 상관없이 독자적으로 복제되는 특징이 있다. 박테리아의 항생제에 대한 내성이 한 세포에서 다른 세포로 옮겨질 때 plasmid를 통해 이루어진다고 알려진 후 항생제 내성에 대한 유전자뿐 아니라 항생제 합성이나 독성물질의 하성, 질소고정 및 분해, 여러 효소들에 대한 유전자를 함께 가지고 있음이 밝혀졌다.
plasmid는 한 세포에서 다른 세포로 옮겨갈 수 있는 성질을 지니고 있으므로 유전자를 옮기는 운반자 혹은 벡터로 작용한다. 외부에서 연구하고자 하는 DNA 조각을 plasmid에 삽입하여 연결시킨 후 박테리아에 넣어주면 이 형질 전환된 세포 내에서 DNA는 독자적으로 복제되므로 DNA조각을 복제하는 벡터로 이용될 수 있다.
분자 유전학 실험에 사용되는 플라스미드는 자연계에 존재하는 플라스미드의 특정 부위를 조합하여 만든 플라스미드가 이용된다. 이러한 플라스미드는 작고 활성이 놓은 relaxed replication origin 을 가지고있으며 적어도 항생제내성에 대한 한 개의 유전자를 지니고 있다. 또한 이를 플라스미드 내에는 한 가지 제한표소에 의해 단지한 군데만 절단될 수 있는 부위를 여러 개 가지고 있으므로 실험실 내에서의 조작을 쉽게 해주고 있다.
Plasmid DNA 분리
주로 miniprep이라고 부르는 방법으로 plasmid DNA를 소량 분리하는 방법이다. 라스미드를 정제는 total cell DNA를 일반적인 분리방법과 같다. 플라스미드를 지니는 세포를 액체배지에서 배양하여 수확하고 cell extract를 하면 된다. extract는 단백질을 제거하고 에탄올침전으로 DNA를 응축시킬 수 있다. 그러나 totall cell DNA 분리와 plasmid 정제와는 중요한 차이점이 있다. 플라스미드 분리는 일반적으로 많은 양의 chromosomal DNA 로부터 분리하여야 한다.
기본적인 원리는 세균의 cell wall과 cell membrane을 부수고 DNA 만을 분리하는 것이다. 이 때 중요한 것은 세균이 원래 가지고 있는 chromosomal DNA와 plasmid DNA를 구분하여 분리하는 것이다. 이 둘은 모두 DNA이므로 성질이 비슷하기 때문에 구분하여 분리하기가 쉽지 않다. 다행히 chromosomal DNA는 분리 과정에서 linear 형태가 되고 크기가 상당히 크기 때문에 이런 성질의 차이를 이용하면 분리할 수 있다. bacterial cells로부터 plasmid DNA를 소량으로 분리하는 방법은 대단히 많지만 성공률과 속도를 생각하여 세 가지 방법으로 소개하면 Alkaline lysis prep, boiling method ,lithium-based procedure 이다.
① Alkaline lysis miniprep
alkaline lysis procedure은 가장 일반적으로 쓰이는 분리방법이다. Plasmid DNA는 plasmid을 지니고 있는 bacteria에서 적은 양의 배양으로 분리될 수 있다. Bacteria는 sodium dodecyle sulfate(SDS), NaOH를 함유하는 용액으로 처리하여 용균되어 진다. 여기서 SDS는 bacterial proteins을 변성시키며 NaOH는 chromosomal DNA와 plasmid DNA를 변성시킨다. 다음 potassium acetate를 첨가하여 혼합액을 중성화시키는데 이것은 covalently closed plasmid DNA를 빠르게 reanneal 시킨다. chromosomal DNA와 bacterial proteins의 대부분은 침전되며 침전물은 원심분리로서 제거할 수 있다. plasmid DNA는 상등액에 남아있게 되고 ethanol precipitation으로 집중시킬 수가 있다.
② Boiling miniprep
Plasmid를 지닌 bacteria는 lysozyme, Triton(a nonionic detergent), 열처리 등으로 깨어질 수 있다. chromosomal DNA는 세포막에 결합된 상태로 남아있게 되고 원심분리로서 침전시켜 모을수 있으며 plasmid DNA는 상등액에서 isopropanol로 침전시켜 분리할 수 있다. boiling miniprep는 적은 양의 plasmid를 분리할 때 쓰이는 방법이지만 분리된 plasmid DNA는 alkaline lysis miniprep 보다 quality가 떨어진다.
③ Lithium miniprep
Plasmid DNA는 평판 또는 액체배지에서 배양되는 E.coli로부터 획득할 수 있는데, Bacterial cells은 Triton X-100/LiCl과 phenol/chloroform을 처리하여야만 한다. 이것은 plasmid DNA의 가용성화와 chromosomal DNA, cellular debris등에 침전을 일으킨다. debris는 원심분리를 통해 제거할 수 있다. 이러한 분리절차로 chromosomal DNA 등을 제외한 plasmid DNA만을 얻을 수 있다. 이번 분리방법은 가장 빠르게 plasmid DNA를 분리하는 방법이며 대부분의 생물학적 적용면에 이용할 수 있는 정제된 plasmid DNA를 분리할 수 있다.
RNA is structurally very similar to DNA. How can you remove RNA during plasmid isolation?
chromosomal DNA는 분리 과정에서 linear 형태가 되고 크기가 상당히 크기 때문에 이런 성질의 차이를 이용하면 분리할 수 있다.
How do you break the cell membranes?
용액A 가 세포벽을 파괴하고, 삼투압을 유지시켜 세포의 외형은 유지해 준다. 그리고 염색체 DNA는 파괴되지 않도록 세호를 유지시킨다.
용액 B 인 0.2N NaOH 1% SDS 로 세포벽와 세포막을 파괴하고 DNA의 renaturation을 한다.
What is the role of ethanol in the current experiment?
100% Ethanol: DNA주위의 수분을 제거하여 물 분자에 대한 친화력을 낮추며, 물 자제의 dielectric constant도 낮추어 DNA의 용해도를 떨어뜨린다. 따라서 DNA끼리 뭉치게 한다.
70%Ethanol: 용액 a,b,c에 의해 포함되었던 소량의 남아 있는 염을 제거한다.
How do you determine the concentration of the plasmid isolated using UV/Vis spectrometry?
EtBr염색약은 자외선을 받아 가시광선으로 파장을 변화시키는 일종의 형광물질로써 푸른빛 계통의 짧은 파장의 빛을 붉은 빛 계통의 긴 파장의 빛으로 바꾸어 내보낸다. 254nm 파장의 UV가 DNA에 부딪힐 때 302~366nm의 파장으로 반사되는데 이 빛은 EtBr에 흡수된 후 590m,정도의 가시광선으로 바뀐다. 즉, gel을 EtBr용액 속에서 staining하면 EtBr이 DNA 이중나선의 염기 사이에 끼어들어가기 때문에 gel에 자외선을 쬐면 DNA에서 형광색이 나와 눈에 보이도록 해 주는 역할을 한다.
실험 기구 및 시약
1. 실험 재료
① 용액 A : GTE buffer
(멸균 후 4℃)50 mM glucose, 25 mM Tris.Cl (pH 8.00), 10 mM EDTA, pH 8.00
(4℃) ethyl alcohol, isopropanol
② 용액B : 0.2N NaOH, 1% SDS, TE buffer 10mM Tris․Cl (pH 8.0) 1mM EDTA (pH 8.0) + RNaseA (20 μg/㎖)
③ 용액 C (4℃) : 5M CH3COOK 60 ㎖, acetic acid 11.5 ㎖, milli-Q water 28.5 ㎖, pH 4.8 + 7.5 M ammonium acetate
④ solution Ⅰ → resuspension solution
Tris-Cl 은 pH를 맞추기 위한 것이고, EDTA는 세포벽의 integrity를 유지하는데 필수적인 calcium ion을 제거하여 세포벽이 군데군데 무너지게 한다. 이때 glucose는 삼투압을 유지시켜 세포의 외형을 유지시켜 준다. 이 과정에서 실험상 vortex를 해야 하는데 이때 세포가 완전히 깨지게 되면 chromosomal DNA가 잘게 깨 지게 되어 plasmid DNA와 구분할 수 없게 된다. 따라서 이렇게 세포를 유지시켜가면서 세포벽만 깨는 것이다.
⑤ solution Ⅱ → lysis solution : SDS, NAOH
SDS는 계면 활성제로 cell을 lysis시키고, NaOH는 DNA가 세포가 깨지면서 밖으로 나왔을 때 DNA을 변성시키는 역할을 한다. Chromosomal DNA가 잘게 부서지지 않게 조심스럽게 처리한다.
⑥ solution Ⅲ → Neutralizatiom solution :Na-acetate
Na-acetate는 강력한 산으로 위에서 NaOH에 의해 염기성이 된 용액을 다시 중성으로 돌려 놓음으로써 DNA 를 재결합시키는 역할을 한다. pH를 급격히 7.0까지 복구시키면 크기가 작고 supercolied form을 유지하고 있던 plasmid는 비교적 renaturation이 잘되지만 chromosomal DNA는 미처 renaturation이 되지 못하고 엉기게 된다. 이렇게 엉긴 chromosomal DNA를 원심분리로 제거되고 상층액에 plasmid DNA가 있게 된다.
실험 방법
1. 실험 과정
① 세포가 담긴 50 ㎖ tube를 3500 rpm과 15 분 동안 원심분리한 후 상층액은 버리고, 깨끗한 티슈 위에 뒤집어서 잠시 동안 방치한다.
② 400 ㎕의 용액 A를 위의 튜브에 넣고 피펫을 사용하여 분산시킨 후, 1.5 ㎖ 크기의 eppendorf tube (ep tube) 4개를 준비하여 각각의 ep tube에 분산액을 100 ㎕씩 담는다.
③ 즉시 각각의 ep tube에 용액 B를 200㎕ 첨가한 후, 부드럽게 6~8 위아래로 섞는다.
④ 150 ㎕의 용액 C를 넣고 10 min 동안 원심분리한다 (13000 rpm).
⑤ 새로운 ep tube에 조심스럽게 맑은 상층액 만을 넣고, 얼음위에 두었던 isopropanol을 500 ㎕를 첨가한 후 얼음 위에서 10 분간 방치한다.
⑥ 최고의 속력 (13000 rpm)으로 10 분간 원심분리한 후, 상층액을 조심스럽게 뽑아서 제거한다.
⑦ 각각의 ep tube에 TE buffer 400 ㎕와 RNase A 10 ㎕ (100 μg/㎖, Sigma R4642)를 넣고, vortexing한 후 37℃ incubator에 20-30 분간 넣어둔다.
⑧ 300 ㎕의 PCIA (Phenol/chloroform/isoamyl alcohol, Sigma P3803, 층이 분리되어 있고, 이 중에 하부 층을 사용함) 첨가한 후 30 초 동안 vortexing한다.
⑨ 위의 tube를 최고 속도에서 5 분 동안 원심분리한 후, 상층액만 새로운 ep tube에 옮긴다.
⑩ 7.5 M ammonium acetate 100 ㎕를 첨가하고, 1 ml absolute ethanol을 첨가한 후, 10 분간 원심분리한다.
⑪ 아스피레이터를 사용하여, 조심스럽게 ethanol solution을 완전히 제거하고, 진공 데시케이터에서 15 분 동안 건조시킨다.
⑫ ddH2O 50 ㎕를 1번 tube에 넣어 침전물을 녹이고, 다시 2, 3, 4번 tube에 차례로 옮겨 DNA를 녹여 낸다.
⑬ UV/Vis spectroscopy (260 ㎚와 280 ㎚에서의 흡광도)를 이용하여 얻어진 plasmid 용액의 농도와 순도를 결정한다.
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