분자생물학실험 | Polymerase chain reaction(PCR)에 의한 DNA절편의 증폭

 

 

 

TIP

 

 

PCR의 원리를 이해하고 실제로 DNA의 절편을 증폭하여 본다.

 

 

 

PCR과 체내 DNA 합성

1. DNA 두 가닥을 푸는 방법

① PCR : 온도를 높여 주어서 DNA 이중나선을 푼다.

② 체내 DNA 합성 : 헬리카아제(DNA helicase)라는 효소를 이용하여 DNA 이중나선을 풀고, 단일 가닥 DNA 결합단백질(single strand DNA binding protein)이 분리된 DNA 사슬이 다시 되붙지 못하도록 막는다.

 

2. 사용하는 polymerase

① PCR : DNA 이중나선이 풀어서 합성해야 하므로, 내열성 DNA polymerase인 Taq polymerase를 사용한다.

② 체내 DNA 합성 : 체내에서는 많은 효소를 사용하기 때문에 내열성 DNA polymerase를 필요로 하지 않는다.

 

3. 반응이 일어나는 온도

① PCR : DNA 이중나선을 풀어주기 위해서는 90℃이상으로 온도를 올려주고, primer를 부착시키기 위해서는 60℃으로 온도를 낮춰주어야 하고, Taq polymerase를 이용하여 합성을 하려면 온도를 72℃로 올려야 한다.

② 체내 DNA 합성 : 많은 효소가 존재하기 때문에 온도의 변화를 줄 필요 없이 체온에서 가장 적합하게 일어난다.

 

4. primer와 오카자키 절편의 생성

① PCR : DNA 이중나선을 완전히 분리한 후에 일어나고 targer DNA를 증폭시키기 위해서는 forward primer와 reverse primer가 필요하기 때문에, 지연가닥이 생기지 않아 오카자키 절편도 생성되지 않는다.

② 체내 DNA 합성 : 헬리카아제(DNA helicase)로 DNA 이중나선을 풀어가면서 DNA 합성이 일어나기 때문에 한쪽 가닥은 연속적으로 일어나는 선도가닥이 되고, 나머지 한쪽 가닥은 오카자키 절편이 생성되는 지연가닥이 된다. 지연가닥에서는 하나의 primer가 하나의 오카자키 절편을 생성하는 것이다.

 

 

실험 방법

1. 실험 과정

1) DNA 및 다른 시료들을 아래 표의 농도로 준비한다.

 

2) 시료들은 DW, buffer, DNA, Taq polymerase 순으로 섞는다.

 

3) 아래의 반응 조건에서 PCR을 수행한다.

 

 

4) Reaction 조건

 

 

 

 

[분자생물학실험]Polymerase chain reaction(PCR)에 의한 DNA절편의 증폭 레포트