분자생물학실험 | Real–Time PCR

 

 

 

TIP

 

 

real-time PCR의 기본원리를 이해하고, 직접 real-time PCR을 수행하여, DNA를 많은 양으로 증폭시킨다.

 

 

 

DNA polymerase (DNA 중합 효소)

PCR의 반응은 DNA 중합효소에 연관되어 있으며 좋은 효소를 선택하는 것이 좋은 결과를 얻기 위해서 중요하다. 낮은 온도에서 나타나는 Taq DNA 중합효소의 활성이 PCR 반응의 특이성에 영향을 미치는 원인 중 하나다. 이러한 경우 primer는 DNA에 비특이적으로 결합하게 되며 비특이적인 산물을 만들어내게 된다. 이러한 문제를 최소화하기 위해서 “hot-start” 기능을 가진 효소를 사용해야 하는데 이 효소는 낮은 온도에서나 초기 DNA denature 과정에서의 Taq의 활성을 억제하게 되어 이러한 비특이적인 산물을 만들어내는 것을 방지해주는 역할을 한다.

 

 

Reverse transcriptase (역전사 효소)

역전사 효소는 qRT-PCR의 성공에서 DNA 중합효소와 마찬가지로 중요한 요소이다. 이러한 역전사 효소를 어떠한 것을 선택하냐에 따라 온전한 cDNA의 합성 수율이 높아지며 또한 높은 온도에서도 좋은 활성을 유지하게 된다. 높은 온도는 실험에서 RNA의 2차 구조를 파괴하여 RNA를 cDNA에 만드는데 도움을 주는 중요한 역할을 하게 된다.

 

 

Real-Time PCR Tip

Real-Time PCR 실험을 설계 할 때 몇 가지 유의해야 할 사항들

먼저 증폭하고자 하는 target 유전자의 G+C contents가 60% 이상이거나 반복 서열이 존재하는 target 선정은 피하고, 증폭되는 product는 50～150 bp 크기로 작게 설정하는 것이 유리하다. 무엇보다도 primer가 target 유전자에 대한 특이도가 높아야하기 때문에 melting temperature가 최적화 돼 있어야 한다.

​Real-Time PCR에 사용될 Primer를 제작 할 때는 일반적으로

1) Annealing temperature 값은 55～60℃에 맞춰 설계해야 하며,

2) Primer의 길이는 18～23 base가 이상적이다.

3) Primer sequence 내에 연속된 4개 이상의 base가 반복되지 않도록 주의하며,

4) 3'-end의 5 base는 2개 이상의 G와 C가 포함되지 않도록 설계해야 한다.

 

 

실험 방법

1. 실험 과정

1) 샘플(cDNA)를 spin down을 해서 tube 끝으로 모은다.

 

2) primer희석

고농도이기 때문에 농도를 낮추기 위해 쓴다. nuclease free water를 사용하여 희석을 시켜준다.

 

3) 한 번에 master mix, primer, H₂O를 섞어준다.

master mix : 1 well 당 10㎕ (고정)

primer : sense + antisense 1 well 당 1㎕ (고정)

H₂O : 1 well 당 7㎕ (나머지 volume)

cDNA : 2㎕(cDNA는 마지막에 넣어준다. 큰 volume부터 넣기 위해서)

기포가 생기지 않게 천천히 조심히 넣는다.

3개의 well에 넣는 양 계산

10㎕ × 3.2 = 32㎕

0.5㎕ × 3.2 = 1.6㎕(sense), 0.5㎕ × 3.2 = 1.6㎕(antisense) 총3.2㎕

7㎕ × 3.2 = 22.4㎕

 

4) 설정된 값

RUN setting – profile(annealing T_m값 – 59℃)

denaturation – annealing – extension

50cycle

 

5) 결과

analysis – Auto quant – relative quantification

※ minimum과 maximum의 gap차이가 없어야 된다.

 

	H GAPDH	H GAPDH
비교대상	S	AS

 

5‘～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～3’ SENSE

3‘～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～5’ ANTISENSE

GREEN MASTERMIX(염기, Polymer, 발광물질)

물 : -20℃

 

 

 

 

[분자생물학실험] Real–Time PCR 레포트