제약분석 | DNS assay - 아밀라아제 효소 정량

TIP

 

 

1. DNS method를 이용한 환원당 정량
2. 효소(아밀라이제)의 역가분석

 

 

 

α-Amylase assay

알파-아밀레이스(α-아밀레이스, α-amylase)는 아밀레이스의 한 종류로 셋 이상의 α-1,4연결 포도당 단위를 갖는 다당류에서 α-1,4 글리코사이드 결합을 가수분해시키는 효소이다.

 

 

흡광도

Beer's law에 의하면, 흡광도와 몰농도는 비례한다. x축은 농도로 넣고, y축은 흡광도이다.

 

A = Elc (즉, 흡광도= 몰흡광 계수 × 몰농도 × 셀의 길이)

A : optical density, absorption의 세기입니다. (UV 측정시 실제 얻는값, 흡광도)

c : molar concentration 몰농도,  e : e×tinction coefficient 몰흡광 계수

l : 셀의 길이 1㎝ 이므로 1 만 곱하면 됨 → 보통 측정하는 큐벳은 1㎝×1㎝ 사이즈

 

흡광계수는 e =A/c , 즉 두 개의 값만 알면 구할 수 있음.

 

농도 = 몰농도 값 C

 

위의 공식 A=Elc 에서 c만 남겨두고 나머지 2개 변수를 좌측으로 이항한다. 

1 unit : 환원당 1umole/min

 

 

실험 방법

1. 효소반응

① 기질용액 : 1% starch (100㎖ 준비)

 

② 효소용액 : 알파-amylase

 

③ ep 튜브에 기질용액 1㎖ + 조효소액 0.1㎖을 준비 : 반응액

 

④ 항온수조 37℃에서 30분 반응 → free한 포도당이 생성됨

 

⑤ 반응정지 : 원래 1N Acetic acid로 넣은 후 iodin으로 컬러 판별 하나 정지 없이 바로 다음 단계 진행함

 

 

2. glucose 정량 (DNS 환원당 정량)

① 이것을 통해 잘려진 glucose 양을 보고 효소의 활성도(역가) 측정이 가능하게 됨

 

② ep튜브에 0.5㎖ DNS시약 + 0.5㎖ 샘플 혼합 (1번의 효소반응 후 반응 후 샘플)

 

③ 90℃이상에서 10(5분～15분 정도)분 가열 → red brown color를 띠게됨

 

④0.2㎖ Rochelle salt 첨가

 

 

3. Standard curve 만들기. (㎖)

 

4. sample 흡광도 측정

 

 

 

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