분자생물학실험 | RNA 추출과 RT-PCR

 

 

 

RNA 추출 원리

포유세포는 보통 한 세포 당 10^-5㎖ RNA를 포함하고 있으며 이 중 80∼85%가 rRNA, 15∼20% 가 tRNA, 1∼5%가 mRNA로 이루어져 있다. 리보솜 RNA나 tRNA 등은 일정한 크기와 염기서열을 가 지고 있기 때문에 전기영동, 초 원심 분리 및 크로마토그래피에 의해 순수하게 분리할 수 있는 반면, mRNA는 크기도 다양하고 많은 종류가 혼합되어 있기 때문에 한 종류의 mRNA를 순수 분리 하기가 쉽지 않다. 그러나 진핵세포 mRNA는 3말단에 poly(A)를 가지고 있기 때문에 리보솜 RNA나 tRNA 등으로부터 분리해 낼 수 있다.

 

RNA를 추출할 때 가장 주의해야 할 점은 핵산 가수분해효소에 의해 분해되지 않고 완전하게 얻는 것이며, 또한 단백질이 제거된 순수한 RNA를 얻는 것이다. 모든 세포에 존재하는 ribonuclease의 작용으로부터 RNA를 보호하기 위해서는 RNA 추출 시 사용되는 모든 기구와 시약에 ribonuclease의 오염이 없어야 한다. heparin이나 RNAin은 ri bonuclease의 강력한 저해제로써 분리되지 않는 RNA를 얻는데 매우 유용하다.

 

RNA는 세포내에서 단백질과 결합되어 있으며 그들 간의 친화력은 매우 강하고 단백질을 얼마나 제거하느냐가 RNA의 순도를 결정하게 된다. 단백질을 제거하기 위해 페놀추출, p roteinase k에 의한 단백질의 분해 및 강력한 denaturant인 gvanidinium을 이용한 추출방법과 이들 간의 조합 등 여러 가지 방법에 의한 RNA를 추출한다.

 

순수하고 완전한 RNA를 분리하는 것은 유전자를 클로닝하고 유전자 발현을 분석하는데 대단히 중요하다. 세포로부터 분리된 RNA는 dsDNA로 복제되어 cDNA li brary를 제조하는데 이용되고 이로부터 원하는 cDNA clone을 분리해 낼 수 있다. 완전한 cDNA를 클로닝하기 위해서는 완전한 크기의 RNA를 추출하는 것이 중요하다. 유전자 발현을 분석하는데 있어서 유전자로부터 전사되어 생성된 RNA의 양과 구조를 규명하는 것이 필요하다.

 

 

실험 방법

1. RNA 추출

1) 배지를 버린 후, PBS 2㎖로 washing을 2회한다.

 

2) Trizol 2㎖를 첨가 후 scraper로 긁는다.

 

3) e-tube 2개에 1㎖씩 나누어 담는다.

 

4) chloroform을 300㎕ 첨가한 후 vortexing한다.

 

5) 12000rpm, 4℃, 10분간 centrifuge한다. (아래와 같은 결과가 나타난다.)

 

 

6) pipette의 tip을 표면 가까이에서 천천히 e-tube에 상등액만 400㎕ 취한다.

 

7) isopropyl alcohol을 상등액과 동량인 400㎕ 첨가한 후 10분간 정치한다.

 

8) 12000rpm, 4℃, 10분간 centrifuge한다.

 

9) 상등액을 따라 버린다.

 

10) 70% EtOH 1㎕ 첨가한 후, tube를 up & down 한 후, spin down한다.

 

11) 7500rpm, 4℃, 5분간 centrifuge한다.

 

12) 상등액(70% EtOH)을 tip으로 살살 긁어내어 제거한다.

 

13) kimwipes에 거꾸로 놓아두고 dry한다.

 

14) RNase free water 30㎕에 녹인다.

 

15) 55℃에서 10분간 boiling한다.

 

16) PCR Mixture를 위해 Spectrophotometry을 하여 RNA의 양을 계산한다.(Result에 RNA 양 계산)

 

2. RT-PCR

 

 

1) Mix 1 ( sub total 11㎕)

 

2) tapping 한 후, spin down한다.

 

3) 70℃에서 5분간 PCR 기계로 처리한다.

 

4) 곧바로 ice에 박는다.

 

 

5) Mix 2 ( sub total 19㎕)

 

6) Mix 1 (11㎕) 과 Mix 2 (19㎕) 를 섞어 total 30㎕으로 만든다.

 

7) tapping 한 후, spin down한다.

 

8) 72℃에서 15분동안 PCR 기계로 처리한다.

 

3. PCR

 

 

1) PCR Mixture

 

2) cDNA를 3㎕ 첨가하여 total 30㎕으로 만든다.

 

3) 55℃, 5min

94℃, 1min - ①

55℃, 1min - ②

72℃, 1min

72℃, 10min - ③

 

4) 돌린 후, ①, ②, ③번을 25cycle 돌린다.

 

5) 4℃에서 48시간 보관한다.

 

 

 

[분자생물학실험]RNA 추출과 RT-PCR 레포트