미생물공학실험 | Identification of bacteria by 16S ribosomal RNA gene(rDNA) sequence determination - Bacillus coagulans 탐색

TIP

 

 

Bacillus coagulans의 분리

 

 

 

Bacillus coagulans가 메주의 생성시에 나오는점과 쌀겨발효시 분리된다는 논문을 통해 관찰된다는 점을 통해서 직접 시료로부터 집적배양을 하고 산생성시 균주 선발 및 순수분리 과정을 통해 균주를 선발한후 16s rRNA 유전자 증폭 시키고 염기서열 분석을 하는 것으로 전략을 세웠다.

 

 

 

실험 방법

1. 집적배양 과정

총 4가지 시료 중 {순창 메주,생기몰 메주,재래식 메주(초기,후기),쌀겨} 재래식 메주를 선택하여서 초기,후기 재래식 메주를 각각 10g을 채취후 MRS broth와 항진균제인(Cyclohexmide,NaN3)을 넣어서 농도를 10ppm으로 맞춰주고 autoclave에 50℃로 배양한다.

 

2. spreading 과정

autoclave에 배양했던 것을 꺼내어서 부터 까지 희석시킨뒤 희석시킨 것을 100㎕씩 따서 MRS Agar배지에 speaing을 한다.(배지의 농도는 부터 이 된다) speading한 배지를 초기와 후기로 나누어 각각 랩으로 씌워준뒤 다시 autoclave에 넣어준다

 

3. 균주 선발 및 순수분리 후 유전자 증폭

1) speading 과정 후 autoclave에 넣었던 배지들을 꺼낸뒤 투명환을 생성한 30∼300개의 single colony가 형성 된 것을 고른다.

2) 이쑤시개를 이용하여 균을 채취 후 PCR을 한뒤 PCR의 산물을 전기영동법을 통해 DNA의 단편을 확인하고 UV를 이용하여 DNA의 존재를 확인한 후 염기서열을 의뢰하는 기관에 맡긴다.

3) 검사결과가 나오면 결과가 나온 염기서열을 이용하여 16S RNA sequence의 상동성을 분석한다.

 

 

 

[미생물공학실험]Identification of bacteria by 16S ribosomal RNA gene(rDNA) sequence determination 레포트