식물분자생물학 연습 | Polymerase chain reaction Agarose Gel Analysis

Polymerase chain reaction

중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)은 특정 DNA 부위를 특이적으로 반복 합성하여 시험관내에서 원하는 DNA 분자를 증폭시키는 방법으로서, 아주 적은 양의 DNA를 이용하여 많은 양의 DNA 합성이 가능하므로 분자 생물학적으로 제한효소의 발견만큼 획기적인 것이라고 할 수 있습니다.

 

즉 genomic DNA와 같은 아주 큰 DNA로부터 원하는 DNA 부분만을 선택적으로 증폭시킨 후 일반적으로 사용되는 agarose gel이나 polyacrylamide gel 상에서 뚜렷하게 보이는 band로 가시화할 수가 있습니다. 중합효소 연쇄반응을 통하여 in vitro 상에서 특정 부위의 DNA를 ∼ 배까지 수 시간내에 증폭시킬 수 있으며, 이렇게 증폭된 DNA를 다음과 같이 여러가지 실험에 이용할 수 있고, 실험 결과를 토대로 여러 의학적인 연구에 응용할 수가 있습니다.

 

 

DNA electrophoresis

DNA gel 전기영동 방법은 DNA를 크기에 따라서 분리하는 방법입니다. DNA는 backbone의 phosphate group 때문에 전기영동에 사용되는 buffer에서 음전하를 띄고 있으며 두 전극 사이에 위치했을 때 양극 쪽으로 움직이게 되는 것이 기본원리입니다. 이때 DNA분자가 gel matrix 사이를 통과하는 속도는 분자량이 커질수록 늦어지며 gel matrix가 치밀할수록 늦어지며, 또한 DNA분자량이 같더라도 구조에 따라서 움직이는 속도가 다릅니다.

 

예를 들면 supercoiled DNA는 circular DNA보다 빠르게 움직입니다. Gel의 재료는 agarose나 polyacrylamide가 흔히 쓰이며 분리하고자 하는 DNA의 크기에 따라서 선택합니다. Agarose gel을 100bp이상 20kb까지의 DNA를 분리하는데 사용되며 polyacrylamide gel은 1kb이하 크기의 DNA를 분리하는데 이용합니다.

 

 

실험 방법

1. Polymerase chain reaction & Agarose Gel Analysis

① 식물 잎[아라비답시스(Arabidopsis thaliana)]을 떼어내서 실험용 팁에 넣는다.

② 1.5㎖ 실험용 팁 안의 식물 조직을 갈아 준다.

③ 2x CTAB 200㎕를 넣은 후 다시 갈아 준다.

④ 65℃에서 최소 30분 놓아둔다.

⑤ Chloroform 200㎕를 넣어 준 후에 vortexing 하고, 3분간 원심분리 한다.(12000rpm～13000rpm)

⑥ 원심분리기로 분리한 물질의 상청액을 새로운 실험용 팁에 옮긴다.

⑦ Chloroform 150㎕를 넣고 vortexing 한 후에 원심분리기를 이용해 3분간 원심분리를 한다.

⑧ 원심분리기로 분리한 물질의 상청액 100㎕를 새로운 실험용 팁에 옮긴다.

⑨ 옮긴 상청액의 양 3배의 Ethanol을 넣는다. (optional: Ethanol은 -20℃에서 20분간 놓 아둔 것이어야 함.)

⑩. 5분간 원심분리를 하고 70% Ethanol로 헹궈준다.

⑪ 70%의 Ethanol을 다시 제거 해준 후, 바닥에 뭉친 덩어리를 5분간 말려준다.

⑫ 50㎕의 TE buffer에서 재부유 시키고, PCR반응 마다 1㎕씩 사용한다.

 

2. PCR condition

94℃ 5min

94℃ 30 sec

51℃ 30 sec 40 cycles

72℃ 1 min

72℃ 5 min

 

3. Reaction mixture (total 20 ㎕)

① 14㎕ of dd

② 2㎕ of 10 X buffer

③ 1㎕ of 5mm of dNTP (dGTP, dCTP, dATP, dTTP)

④ 1㎕ X 2 of each primer (total 2 ㎕)

⑤ vortexing 후에 원심분리

⑥ 0.3㎕ of Taq DNA polymerase

⑦ 1㎕ of genomic DNA

⑧ gDNA 와 cDNA 두 가지 mixture를 만든다.

 

 

4. To make an agarose gel (1.5%)

① Weigh 1.5g of agarose (for 100㎖)

② Add into 100 ㎖ of 1 X TBE

③ Melt using a microwave

④ Pour it carefully into agarose gel caster

 

 

 

[식물분자생물학 연습]Polymerase chain reaction Agarose Gel Analysis 레포트