Glucose가 Glucose oxidase에 의해서 분해되는 과정을 통해 효소의 활동을 이해하는 실험이었다. 이때, redox indicator와 glucose가 oxidation될 때 1:1의 비율로 발생하는 hydrogen peroxide의 농도를 UV/VIS spectrophotometer를 통해 구할 수 있었다. 이를 통해 효소 반응이 어떻게 일어나는지 간접적으로 알 수 있었다. 결과적으로 본 실험에서는 효소 반응의 mechanism과 효소를 다루는 실험에서 주의해야 할 점들을 알 수 있다. 본 실험을 간략하게 나타내면 다음과 같다.
여기서 발생한 과산화수소의 농도는 peroxidase를 이용한 또다른 효소반응을 통해 측정할 수 있다. o-dianisidine은 Electron donor 역할을 하는데, 과산화수소에 전자를 제공하고 나면 spectrophotometer에 의해 붉은 기운이 있는 갈색 영역에서 검출할 수 있다. 이 두번째 효소반응을 간략히 나타내면 다음과 같다.
효소반응은 다른 화학반응에 비해 여러 가지 장점을 가지고 있다. 대개 일반적인 화학 반응의 경우, 높은 온도, pH, 압력 조건 하에서 이루어지는 반면, 효소반응의 경우 상온, 대기압 등의 온화한 조건에서도 반응이 일어난다. 이 때문에 이들 반응은 작업자들에게 있어서 일반 화학반응보다 덜 위험하고, 들어가는 비용과 에너지가 적다.
게다가 일반 화학반응에서는 enantiomer selectivity를 갖는 것이 불가능하지만, 효소반응에서는 이것이 가능하다는 장점도 있다. 본 실험에서는 Glucose Oxidase를 이용하여 Glucose로부터 Gluconolactone을 만드는 간단한 효소반응을 하고 Michaelis-Menten equation을 통하여 kinetic parameter를 구하여 본다.
실험 방법
1. Enzyme Reaction
① x gram 의 monosodium phosphate(Na2H2PO4)와 x gram의 disodium phosphate( )를 DDW에 녹여서 x mM (10X)의 phosphate buffer를 만든다.(pH 7.0)
② x gram의 glucose oxidase(x unit)을 phosphate buffer(pH 7.0)에 녹인 뒤, 이 용액을 -20℃의 저온 냉장고에 보관한다.
③ x gram의 glucose(x mM)를 DDW에 녹인다.
④ 순서대로 용액을 섞는다. 먼저 x ㎖의 glucose 용액을 넣고, x ㎖의 buffer 용액을 넣은 후 x ㎖의 DDW를 넣고 마지막으로 x ㎖의 glucose oxidase 용액을 넣는다.
⑤ 온도를 37℃로 유지시키면서 반응을 시작한다.
⑥ 다음 2번 실험을 통해 reaction solution을 분석한다.
2. Glucose 산화반응의 반응물 농도 측정
① 용액 준비: 미리 준비한 표준 용액을 이용한다.
② 반응 실험
Ⓐ 표준용액(phosphate buffer, electron donor, peroxidase)를 5개의 vial에 나누어 담아둔다.
Ⓑ Glucose 용액 5㎖에 GOD 용액 5㎖를 넣어 시간별로 반응을 시작한다. (온도는 37 ℃로 유지)
Ⓒ 시간별로 반응이 끝난 용액은 0.5㎖를 추출하여 표준용액(Peroxidase 2.5㎖, electron donor 5㎖)을 넣고 450 ㎚ 파장에서 흡광도를 측정한다
Ⓓ 다른 농도의 glucose 용액 또한 같은 방법으로 실험을 수행한다.
3. Measurement of concentration of hydrogen peroxide
① 20mM의 buffer 용액을 준비한다.(pH 7.0)
② x gram의 peroxidase(x unit)를 phosphate buffer에 녹이고, 이 용액을 -20℃의 저온 냉장고에 보관한다.
③ x ㎖의 hydrogen peroxide(x ㎖)와 DDW를 섞고, 이 용액을 -4℃의 저온 냉장고에 보관한다.
④ x gram의 o-dianisidine(x mM)을 ethanol 에 녹인다.
⑤ 다음 순서대로 용액을 섞는다. 먼저 hydrogen peroxide 용액을 넣고 phosphate buffer 용액을 넣은 후, o-dianisidine 용액을 섞고, 마지막으로 peroxidase 용액을 넣는다.
⑥ 곧바로 UV/Vis spectrophotometer로 450㎚에서 흡광도를 측정한다.
4. Determination of kinetic parameters
① Hydrogen peroxide의 농도를 변화시켜가며 초기 속도를 체크한다.
② Michaelis-Menten equation에 따라 plot을 하고 kinetic parameter를 결정한다.
[화학생물공정실험]Production of Glucono-D-Lactone from Glucose Using Glucose Oxidase 레포트
1. 실험 이론 및 원리 가. 실험 요약 Glucose가 Glucose oxidase에 의해서 분해되는 과정을 통해 효소의 활동을 이해하는 실험이었다. 이때, redox indicator와 glucose가 oxidation될 때 1:1의 비율로 발생하는 hydrogen peroxide의 농도를 UV/VIS spectrophotometer를 통해 구할 수 있었다. 이를 통해 효소 반응이 어떻게 일어나는지 간접적으로 알 수 있었다. 결과적으로 본 실험에서는
www.happycampus.com
댓글