미생물실험 | Recovery and digestion of the amplified DNA

 

 

 

TIP

 

 

PCR로 증폭된 DNA를 회수하여 절단한다. 그로 인해 형질전환 때, vector을 넣을 DNA를 얻고, 절단하여 vector를 넣고자 함이다. 이 때, vector DNA와 insert DNA 모두 같은 효소로 같은 위치를 절단하고자 한다.

 

 

 

Restriction enzyme(제한효소)

DNA 특정부위를 자르고 붙일 수 있다. DNA를 자른다는 것은 nucleotide들이 연결되어 있는 인산디에스테르결합(phosphodiester bond)을 끊어내는 것을 의미하는데, 이런 역할을 하는 효소를 nuclease라고 하며 바깥쪽을 자르면 exonuclease, 안쪽을 자르면 endonuclease라고 부른다.

 

endonuclease의 대표적인 것이 바로 제한효소(restriction enzyme / restriction endonuclease)이며, DNA에 존재하는 특정한 염기서열을 인식하고 인식한 서열부위 또는 그 근처에 존재하는 특정부위를 절단한다. 즉, 염기배열을 인식하여, 그것을 기준으로 한 위치에서 특정 염기의 이중사슬을 절단하는 endonuclease이다. 유전공학에서 재조합 DNA를 만들기 위해서 사용한다.

 

제한효소는 원래 세균이 자신의 세포 내로 침입해 들어오는 바이러스와 같은 외부 DNA를 제거하기 위한 방어기전으로 가지고 있다. 그러나 제한 효소는 자신의 DNA도 절단할 수도 있기 때문에 그것을 방지하기 위해 세균은 자신의 DNA에 메틸화(methylation)을 하는 등의 방법을 통해 자신의 DNA를 보호한다. 즉, 수식효소는 제한효소와 거의 같은 자리를 절단하는데, 메틸화하여 제한을 받지 않게 하며, 메틸화로 외부 DNA를 식별한다.

 

제한 효소마다 버퍼가 있으며, 이 버퍼에 따라 절단 위치가 정해지고, 없다면 무작위로 절단한다. 1unit=1sec/㎍으로 하며, 만일 2부위를 절하는 공통버퍼가 없다면 우선 하나의 버퍼를 넣고, clean-up까지 한 후에, 다름 버퍼를 넣는다. nuclease는 DNase와 RNase, exonuclease와 endonuclease, random digestion과 specific site digestion으로 나뉘며, 제한 효소는 specific site digestion하는 endonuclease이고, DNase이다. 그리고 보통 typeⅡ를 재조합에 쓴다.

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실험 방법

1. 제한효소처리

※ 각 튜브에 총 30㎖의 용액을 만들 예정이다.

1) PCR products enzyme digestion

① 각 튜브(새 튜브)에 dH2O 15㎖씩 넣는다.

 

② 각 튜브에 EcoRⅠ Buffer (×10) 3㎕씩 넣는다.

 

③ 각 튜브에 sample을 10㎕씩 넣는다

 

④ 각 튜브에 EcoRⅠ 1㎕와 HindⅢ 1㎕를 넣는다.

 

⑤ 3시간동안 incubator에 넣어 기다린다.

 

⑥ 이 후, 37℃에 보관한다. 이때, EcoRⅠ와 HindⅢ의 활성온도가 37℃이다.

 

2) pBGS18 enzyme digestion

① 각 튜브(새 튜브)에 dH2O 15㎖씩 넣는다.

 

② 각 튜브에 EcoRⅠ Buffer (×10) 3㎕씩 넣는다.

 

③ 각 튜브에 sample을 10㎕씩 넣는다

 

④ 각 튜브에 EcoRⅠ 1㎕와 HindⅢ 1㎕를 넣는다.

 

⑤ 3시간동안 incubator에 넣어 기다린다.

 

⑥ 이 후, 37℃에 보관한다.

 

 

 

[미생물실험]Recovery and digestion of the amplified DNA 레포트