미생물학실험 | 세균 개체수 측정

 

 

 

TIP

 

 

1. 세균수를 측정하는 방법을 알아보자
2. Hemocytometer를 이용해 현미경을 통해 육안으로 세균수를 측정해보자.
3. 분광광도계를 이용해 세균수를 측정해보자

 

 

 

Hemocytometer를 이용한 세포 계수법

페트로프-하우저 계수기, hemocytometer를 이용하는 방법은 세균용 계산판에 균액을 한 방울 떨어뜨리고 일정구획 내의 세균을 직접 현미경으로 보면서 계산하는 방법이다. 생균, 사균을 포함한 진균수를 측정하는 방법으로 균수가 너무 적으면 부정확한 단점이 있다.

 

Hemocytometer에 cover glass를 덮고 시료 10㎕ 취하여 hemocytometer의 측면의 홈에 loading 한다. (모세관 현상에 의해 고루 퍼짐. 1회용 C-Chip의 경우 cover glass는 필요 없음.)

 

 

현미경으로 관찰하면서 세균 수를 계수한다. Hemocytometer를 현미경 하에서 관찰하면 다음 그림과 같은 grid를 볼 수 있다.

 

 

크게 9개의 사각형이 있으며, 각각의 사각형은 가로, 세로가 1㎜인 정사각형으로 이루어져있다. 각 모서리의 4칸의 세균 수를 센 후 그 합을 4로 나누어 평균을 구한다.

 

하나의 square의 부피는 10^-4㎖ 이다. (가로 1㎜×세로 1㎜×cover glass를 덮었을 때의 높이 0.1㎜ = 0.1㎣ = 10^-4 ㎖) 예를 들어 A, B, C, D 네 칸의 cell 수를 세었을 때 50이 나온다 치면, 1㎖ 당 세균 수는 50 × 1/4 × 10⁴  = 12.5×10⁴ 개가 된다. 그리고 결과에 시료의 희석 배수만큼 곱해주면 원액(희석 전)의 세균 수를 측정할 수 있다.

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실험 방법

1. 혈구계를 이용해 세균수 측정하기

1) 물 9㎖에 박테리아 현탁액 1㎖를 넣어 희석한다.

 

2) 물 9900㎕에 위의 희석액을 100㎕를 넣어 희석한다.

 

3) 최종 희석액을 혈구계에 로딩하고, 현미경을 통해 관찰한다.

 

2. 분광광도계로 세균수 측정하기 & 알려진 데이터를 이용해서 세균수 예상하기

1) 대장균 배양액(A) 1㎖를 스포이드를 이용해서 배지 1㎖에 넣는다.

 

2) 스포이드로 희석액(B)를 흡입했다 방출하길 반복해서 잘 섞이도록 한다.

 

3) 이 희석액(B) 1㎖를 다시 배지 1㎖에 넣고, 잘 섞어준다.

 

4) 위와 같은 방식으로 희석액 (C), (D)를 만든다.

 

5) spectrophotometer를 이용해서 희석액 4개와 배양액, 배지의 분광도를 측정한다.

 

6) 측정된 희석액 (A), (B), (C), (D)의 분광도에서 배지의 분광도를 빼서 배지를 제외한 세균의 분광도를 구한다.

 

7) 이 데이터를 이용해서 x는 희석배율, y는 분광도의 그래프를 그리고 x, y의 방정식을 구한다.

 

8) 대장균의 경우 분광도가 0.2일 때, cloning forming unit의 값이 1× 10⁷cfu/㎖임을 이용해서 위의 방정식의 희석 배율 얼마가 이에 해당하는지 구한다.

 

 

 

[미생물학실험] 세균 개체수 측정 레포트