생화학실험 | DNS 법을 이용한 환원당 정량분석 - The quantitative analysis of reducing sugar by DNS method

 

 

 

TIP

 

 

1. 화학물의 흡광도를 측정하여 정량 분석하는 것이다. 흡광도는 전자 전이에 따른 흡수물질의 농도에 따라 다르게 나타나기 때문에, 흡광도를 통해 정량분석을 할 수 있다. 미지시료의 흡광도와 표준용액의 흡광도를 비교하여 알 수 있다.
2. 환원당(reducing sugar)을 DNS (3,5-dinitrosalicylic acid)와 Rochelle 염으로 발색하여 흡광도를 측정하는 당 정량법을 실험해 보자. 이 방법은 조작이 간편하면서도 저렴하게 원하는 결과를 얻을 수 있어 널리 사용되고 있다.
3. 환원당(reducing sugar)의 성질을 이용하여 시료 중 환원당의 농도를 정량한다.
4. DNS법의 원리는 환원당과 3,5-dinitrosalicylic acid가 반응하여 환원되어 생성된 3-amino-5 -nitrosalicylic acid의 흡광도를 측정하여 당을 정량한다. 당의 환원력은 당의 종류에 따라 차이가 있고 반응 조건에 따라 다르므로 상대적인 양의 함량만을 측정할 수 있다. 이 반응은 알칼리성에서 잘 일어나며 발색되기에 비 특이적이므로 모든 reducing compound와 반응한다.
5. saccharides(당류)에 free carbonyl group (C=O)가 있으면 환원력이 나타난다. 이러한 환원력을 이용하여 발색시약인 3,5-dinitrosalicylic acid (DNS)를 알칼리 조건에서 환원시키면 이 DNS는 3-amino-5-nitrosalicylic acid로 환원되면서 540∼575㎚ 범위의 빛을 흡수하여 된다. 이렇게 발색되는 정도는 시료에 존재하는 환원당과 정량적으로 비례하며 UV-Vis Spectrophotometer를 이용하여 발색되는 정도를 Absorbance로서 측정하여 정량분석을 할 수 있게 되는 것이다
6. 분광광도계의 사용방법을 익힌다. DNS를 환원당에 의하여 환원시켜 생성된 물질을 광도계를 이용하여 흡광도를 측정하여 정량 분석한다. 흡광도는 전자 전이에 따라, 흡수물질의 농도에 따라 다르게 나타나기 때문에 이를 이용해 환원당의 농도를 정량 분석한다. 575㎚에서 흡광도를 측정하여 glucose solution을 이용하여 그린 표준곡선을 이용하여 정량 분석한다.

 

 

 

환원당에 의하여 3,5-dinitrosalicylic acid, DNS이 환원되어 생성된 3-amino-5-nitrosalicylic acid의 흡광도를 측정하여 당을 정량 분석한다. 당의 환원력은 당의 종류에 따라서 차이가 있고. 또 반응조건에 따라서 다르므로 상대적인 양의 함량만을 측정할 수 있다.

 

이 반응은 알칼리성에서 일어나므로 반응용액을 알칼리성으로 만들어 발색을 증가시키고, 생성된 3-amino-5-nitrosalicylic acid을 안정화키기 위하여 DNS시약에 NaOH, Potassium Sodium Tartrate(Rochelle염), Phenol 및 를 첨가한다. 이 방법은 당의 환원력을 이용한 것이므로 환원당뿐만 아니라 시료에 있는 다른 환원성 물질에 의해서도 흡광도가 증가하므로 유의하여야 한다.

 

DNS(3,5-Dinitrosalicylic acid)는 환원당을 측정하는데 사용하는 시약이며 설탕자체는 비환원당으로 환원당이 아니라 DNS로 측정을 할 수 없으나 이 설탕이 가수분해되면 포도당, 과당 따위가 생성된다고 한다. 즉, 탄수화물은 단당류, 이당류, 다당류로 나뉘며 단당류와 이당류 중 알데히드기(R-CHO)와 케톤기(R-CO-R')의 존재에 따라 환원성이 있는 환원당과 환원성이 없는 비환원당으로 나누어진다.

 

환원당은 반응성 있는 알데히드기, 케톤기를 갖고 금속염 알칼리용액을 환원시키는 성질이 있는 당의 총칭입니다. 포도당(glucose), 과당(fructose), 맥아당(maltose), 유당(lactose), 갈락토스(galactose) 등이 포함된다. 설탕과 전분 등과 같이 다른 물질을 환원시키지 못하는 당을 비환원당이라고 하는데, 설탕은 비환원당이지만, 산과 함께 가열하면 포도당과 과당으로 분해하므로 환원력이 생긴다.

 

본 실험에서 흡광도를 측정하여 물질을 정량분석인데 흡광도는 전자전이에 따라, 흡수물질의 농도에 따라 다르게 나타나기 때문에 이를 이용해 물질을 정량 분석하는 것이다. 즉, 환원당을 함유한 시료를 제조하여 시료가 든 시험관에 DNS시약을 넣고 물중탕한 후, 냉각시키면 발색반응이 일어나면 흡광도를 측정한다. 미지시료 용액의 흡광도와 표준용액의 흡광도를 비교하면 흡광도에 따른 농도를 구할 수 있게 된다. 농도가 증가함에 따라 흡광도도 증가하게 된다

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실험 방법

1. 시료의 환원당 측정

1) 용액 1㎖당 0.1∼1.0㎎의 환원당을 함유하도록 시료를 제조한다.(수분증발방지위해 파라필름 밀봉)

 

2) 90℃ 이상에서 시료 1.0㎖에 3.0㎖의 DNS시약을 넣고 90℃이상에서 5분간 물중탕하여 적갈색이(red brown color) 나오게 한후, 1㎖의 potassium sodium tartrate 용액을 넣고 색이 안정되게 한다. 그리고 상온에서 충분히 냉각시킨다.

 

3) 발색반응이 일어나면 이용액의 흡광도를 550㎚∼575㎚에서 측정한다. 이때 만약 시료의 흡광도가 너무 높이 나오면 적당히 희석하여 다시 측정하도록 한다. 

 

2. 표준곡선의 작성

표준 당 용액을 적당한 농도 간격으로 물로 희석하여 1㎖당 0.1∼1.0㎎의 글루코오스를 함유하는 용액을 만들어 흡광도를 측정하고, 그로부터 표준곡선을 그린다.

 

3. 계산

시료의 흡광도를 표준곡선과 비교하여 환원당의 양을 계산한다. 같은 방법으로 표준물질로 검량선(standard curve)을 작성하여, 미지시료(unknown sample)에 포함되어 있는 환원당의 량을 계산한다.

 

 

 

[생화학실험]DNS 법을 이용한 환원당 정량분석 레포트