화학생물공정실험 | DNA의 농도 및 순도의 측정과 Denaturation 및 Renaturation

 

 

 

TIP

 

 

DNA의 정량방법에 대하여 습득하고, 온도에 따른 변화를 확인함으로서 DNA의 생화학적 특성을 이해한다.

 

 

 

DNA 농도측정

DNA를 얻었으면 얼마나 있는가, 얼마나 정제되었는가(다른 불순물이 없는가) 알 필요가 있는데 이는 자외선 분광광도 비색 측정법으로 측정한다. Spectrophotometry의 원리는 특정 파장의 빛을 액체에 통과시키면 빛의 강도가 감소하는 것이다. 물질에 따라서, 또 파장에 따라서 빛의 강도의 감소정도가 일정하므로 이것으로 특정 물질의 농도와 다른 물질(불순물)의 농도를 알 수 있다.

 

(자외선 흡수 복사량은 DNA량에 비례; 260㎚에서 흡광도 1.0 은 50㎍의 복선 DNA양과 일치- 260㎚와 280㎚에서 흡광도 비율은 1.8이다. 측정치가(비율이) 1.8미만이면 DNA시료에는 단백질이나 Phenol이 있다는 것이다. DNA와 RNA는 260 ㎚의 빛을 흡수한다. 흡광도(A₂₆₀)이 1일 때, double strend DNA 의 농도가 50 ㎍/㎖, single strend DNA 의 농도가 33 ㎍/㎖, RNA 의 농도가 40 ㎍/㎖ 으로 알려져 있으므로, 이를 이용하여 DNA와 RNA의 농도를 알 수 있다.

 

 

주된 불순물인 protein의 농도는 A₂₈₀ 을 동시에 측정하여 알 수 있다. 일반적으로 A₂₆₀와 A₂₈₀의 비가 1.6 - 2.0 정도면 순수한 DNA나 RNA로 본다. 따라서 그래프에서 붉은 색이 순수한 DNA 혹은 RNA의 경우이고, 단백질이 포함된 것을 의미한다.

 

농도계산 : 흡광도 측정 값ⅹ희석비율(%)ⅹDNA측정 상수 값 (50) or RNA측정 상수 값 (40)/단위 ㎕로 환산

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DNA Renaturation

변형된 DNA가 다시 원래의 상태로 되돌아오도록 처리할 수 있는데, 이런 과정을 renaturation 또는 reannealing이라고 하고 원래의 형태로 되돌아온 DNA를 재생된 DNA라고 한다. 재생되기 위해서는 두 가지 조건이 필요하다.

 

첫째, 두 가닥내의 인산기 사이에 정전기적 반발이 없어질 정도로 염의 농도가 높아야 한다. 대개 0.15-0.50M NaCl이 사용된다.

 

둘째, 온도는 한 가닥 내에서 이루어지는 임의의 수소결합이 다시 파괴될 정도로 높아야 한다. 그러나 너무 높아서도 안되고, 가닥간의 안정된 염기쌍이 이루어질 정도로 낮아서도 안 된다. 재생을 위한 최적온도는 T_m보다 20-25℃ 낮아야 한다.

 

재생속도는 나선이 다시 꼬이는 시간에 의하여 좌우되는 것이 아니라, 상보적인 두 가닥 사이에서 염기쌍이 정확하게 일어날 수 있도록 두 가닥이 접근할 수 있는 확률에 의존한다. 이것은 오직 임의의 운동결과이기 때문에, 재생기간은 농도에 의해 좌우된다.

 

 

 

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