분자생물학실험 | RNA Isolation and analysis

 

 

 

TIP

 

 

세포에서 RNA를 추출하기 위해서 RNA를 RT–PCR 하여 cDNA 상태로 만들고 cDNA를 PCR 하여 sample을 loading 하고 band를 확인하기 위함이다.

 

 

 

RNA 추출 원리

포유세포는 보통 한 세포 당 10-5㎖ RNA를 포함하고 있으며 이 중 80∼85%가 rRNA, 15∼20% 가 tRNA, 1∼5%가 mRNA로 이루어져 있다. 리보솜 RNA나 tRNA 등은 일정한 크기와 염기서열을 가 지고 있기 때문에 전기영동, 초 원심 분리 및 크로마토그래피에 의해 순수하게 분리할 수 있는 반면, mRNA는 크기도 다양하고 많은 종류가 혼합되어 있기 때문에 한 종류의 mRNA를 순수 분리하기가 쉽지 않다. 그러나 진핵세포 mRNA는 3말단에 poly(A)를 가지고 있기 때문에 리보솜 RNA나 tRNA 등으로부터 분리해 낼 수 있다.

 

RNA를 추출할 때 가장 주의해야 할 점은 핵산 가수분해효소에 의해 분해되지 않고 완전하게 얻는 것이며, 또한 단백질이 제거된 순수한 RNA를 얻는 것이다. 모든 세포에 존재하는 ribonuclease의 작용으로부터 RNA를 보호하기 위해서는 RNA 추출 시 사용되는 모든 기구와 시약에 ribonuclease의 오염이 없어야 한다. heparin이나 RNAin은 ri bonuclease의 강력한 저해제로써 분리되지 않는 RNA를 얻는데 매우 유용하다.

 

RNA는 세포내에서 단백질과 결합되어 있으며 그들 간의 친화력은 매우 강하고 단백질을 얼마나 제거하느냐가 RNA의 순도를 결정하게 된다. 단백질을 제거하기 위해 페놀추출, proteinase k에 의한 단백질의 분해 및 강력한 denaturant인 gvanidinium을 이용한 추출방법과 이들 간의 조합 등 여러 가지 방법에 의한 RNA를 추출한다.

 

순수하고 완전한 RNA를 분리하는 것은 유전자를 클로닝하고 유전자 발현을 분석하는데 대단히 중요하다. 세포로부터 분리된 RNA는 dsDNA로 복제되어 cDNA library를 제조하는데 이용되고 이로부터 원하는 cDNA clone을 분리해 낼 수 있다. 완전한 cDNA를 클로닝하기 위해서는 완전한 크기의 RNA를 추출하는 것이 중요하다. 유전자 발현을 분석하는데 있어서 유전자로부터 전사되어 생성된 RNA의 양과 구조를 규명하는 것이 필요하다.

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실험 방법

1. 실험 과정

1) Trizol 1㎖를 준비되어 있던 세포 pellet에 넣어 섞어준다.

 

2) Trizol 1㎖가 들어가 있는 microtube 에 chloroform 200㎕를 섞어 inverting을 강하게 10회 이상 실시한 후 3～5min 동안 상온에 세워 층 이 분리되도록 한다.

 

3) 원심분리기를 이용하여 4℃에서 13200rpm으로 13분 동안 층을 분리한 다.

 

4) 층이 분리된 tube를 조심히 옮겨와 맨 위에 RNA층을 새로운 tube 에 옮긴다.

 

∴ RNA 침전

5) 4번 과정에서 새로운 tube에 옮겨진 RNA층에 Isopropanol 500㎕를 첨 가하여 10회 이상 강하게 Inverting을 실시한 후, 7～10분 동안 상온에 보관하여 Isopropanol과 RNA의 반응을 기다린다.

 

6) 원심분리기를 이용하여 4℃에서 12000rpm으로 10분 동안 RNA를 침전 시킨다.

 

∴ RNA washing

7) 6번 과정 결과로 침전된 RNA pellet을 제외하고, 나머지 위의 층을 버 린 다음 75% EtOH를 첨가한다.

 

8) 원심분리기를 이용하여 4℃에서 13200rpm으로 5분 동안 RNA를 washing 한다.

 

9) DEPC water 50㎕를 RNA pellet에 넣어 RNA를 녹여준다.

 

10) Heat block을 이용하여 70℃에서 10분간 반응시킨 뒤, ice에서 cooling 한다.

 

11) nano drop을 이용하여 RNA를 정량하고 RT – PCR을 실시한다.

 

∴ RT – PCR

 

12) 이제 RT - PCR 결과로 얻어진 cDNA를 이용하여 PCR을 진행 할 수 있다.

 

∴ PCR

 

13) 1% Agarose gel make

① gel 캐스터를 조립한다.

② 삼각 플라스크에 Agarose

③ 전자레인지에 agarose가 담긴 삼각 플라스크의 머리 부분을 막고, 1～3분 돌려 agarose가 녹는지 확인한다.

④ 녹은 agarose가 담긴 삼각 플라스크를 수돗물을 이용하여 식히고, EtBr 100㎕를 첨가하여 gel 캐스트에 부어 굳힌다.

 

14) 만들어진 Agarose gel에 PCR 반응을 한 Sample을 loading 하여 결 과로 나온 band를 확인하여 분석해본다.

 

 

 

[분자생물학실험]RNA Isolation and analysis 레포트