생화학실험 | PCR-Mediated Mutagenesis

 

 

 

TIP

 

 

PCR의 종류와 원리에 대해서 알아보고 PCR-mediated deletion 실험을 통해 DNA의 원하는 부위를 제거하여 증폭할 수 있다.

 

 

 

Site-directed mutagenesis

Site-directed mutagenesis는 특정 DNA 염기서열에 돌연변이를 도입하는 기법으로 분자생물학의 핵심기술이다. PCR을 응용한 다양한 site-directed mutagenesis 기법이 개발되었으며 계속 진화하고 있다. 이를 "PCR-mediated site-directed mutagenesis"라고 한다.

 

최근 가장 진화한 형태인 "overlap extension PCR"이 널리 이용되고 있다. Overlap extension PCR은 돌연변이(substitution, insertion, and deletion)를 원하는 위치에 아무 제한 조건 없이 도입할 수 있는 매우 유용한 기법이다. 특히, insertion (deletion)의 크기에 상관없이 (1bp->10kbp), 특정위치에 돌연변이를 도입할 수 있는 장점이 있다.

 

 

실험 방법

1. Primary PCR

1) PCR tube를 4개를 준비하고 2개씩 나누어 labeling한 후, 테이블처럼 tube에 넣음.

 

 

1, 2번 tube에는 A, B primer, 3, 4번 tube에는 C, D primer를 넣어준다. DW를 제일 먼저, polymerase를 가장 나중에 넣는다.

 

2) PCR을 25cycles 돌린다.

 

 

3) 1시간 30분 후, sample을 꺼내고 1, 2번 tube끼리 합치고, 3, 4번 tube끼리 합친 후, DNA loading dye를 섞는다.

 

4) 두 개의 sample을 gel에 size marker와 함께 loading 한다.

 

5) EtBr staining 후, UV-transilluminator를 사용하여 각각 다른 위치에 뜬 해당 부위의 gel을 칼로 잘라 e-tube에 담는다.

 

6) E-tube에 세 배 정도의 부피의 Lysis buffer를 집어 넣고 55℃에서 녹인다.

 

7) Column에 800㎕를 넣고 13,000rpm에서 1분간 centri

 

8) Washing buffer 700㎕를 넣고 1분간 centri

 

9) 빈 column을 1분간 centri

 

10) Column을 새 e-tube에 옮기고, 마를 때까지 10분 간 대기한 뒤 DW를 15㎕ 넣고 1분간 대기한 뒤 다시 13,000rpm에서 1분간 centri

 

11) DW 15㎕를 다시 넣고 1분간 centri (두 번에 나눠서 elution 하기 위함)

 

2. Ligation PCR

 

1) PCR tube 하나를 준비하여 위의 테이블처럼 순서대로 넣어준다.

 

2) PCR을 25cycle 돌린다.

 

 

3) Primary PCR와 Ligation PCR 후의 product를 같이 gel을 내려 그 크기를 확인한다.

 

 

 

[생화학실험] PCR-Mediated Mutagenesis 레포트