1. ROS(Reactive Oxygen Species) 활성산소 pathway 및 radical에 의한 인체 내 산화적 스트레스에 대해 이해하고, radical 소거활성능 측정법 중 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH)법으로 항산화 활성을 측정한다.
2. 안정한 자유 라디칼인 2,2-diphenyl-1-picryl hydrazyl (DPPH)을 이용하여 일정량의 시료 용액과의 반응에 의하여 DPPH 라디칼이 감소하는 정도를 분광광도계로 측정하여 간접적으로 시료의 항산화 활성을 한다.
활성산소는 ‘프리라디칼(free radical)' 혹은 ’자유기‘ ’유리기‘라고 불린다. 활성산소는 동식물의 체내 세포들의 대사과정에서 생성되는 산소화합물로 노화나 동맥경화, 암 등의 원인과 관계가 있는 것으로 알려지고 있다. 유해산소라고도 한다. 우리가 호흡하는 산소와는 완전히 다르게 불안정한 상태에 있는 산소이다. 환경오염과 화학물질, 자외선, 혈액순환장애, 스트레스 등으로 산소가 과잉생산된 것이다. 이렇게 과잉 생산된 활성산소는 사람 몸속에서 산화작용을 일으킨다.
이렇게 되면 세포막, DNA, 그 외의 모든 세포 구조가 손상당하고 손상의 범위에 따라 세포가 기능을 잃거나 변질된다. 이와 함께 몸속의 여러 아미노산을 산화시켜 단백질의 기능 저하도 가져온다. 그리고 핵산을 손상시켜 핵산 염기의 변형과 유리, 결합의 절단, 당의 산화분해 등을 일으켜 돌연변이나 암의 원인이 되기도 한다. 또한 생리적 기능이 저하되어 각종 질병과 노화의 원인이 되기도 한다.
그러나 활성산소가 나쁜 영향을 주는 것만은 아니다. 병원체나 이물질을 제거하기 위한 생체방어과정에서 산소·과산화수소와 같은 활성산소가 많이 발생하는데, 이들의 강한 살균작용으로 병원체로부터 인체를 보호하기도 한다. 현대인의 질병 중 약 90%가 활성산소와 관련이 있다고 알려져 있으며, 구체적으로 그러한 질병에는 암·동맥경화증·당뇨병·뇌졸중·심근경색증·간염·신장염·아토피·파킨슨병, 자외선과 방사선에 의한 질병 등이 있다.
따라서 이러한 질병에 걸리지 않으려면 몸속의 활성산소를 없애주면 된다. 활성산소는 대부분 음식물을 섭취해 에너지로 바꾸는 신진대사 과정에서 생긴다. 반면 우리 몸에는 활성산소를 해가 없는 물질로 바꿔주는 효소(항산화효소)도 있어 활성산소의 무제한 증가를 막아준다. SOD(Superoxide Dismutase), 카탈라아제, 글루타치온 페록시다아제, 빌리루빈, 멜라토닌 등이 대표적인 활성산소를 제거하는 항산화 효소다.
그리고 활성산소를 없애주는 물질인 항산화물에는 비타민E, 비타민C, 요산, 빌리루빈·글루타티온, 베타 카로틴, 셀레늄 등이 포함된다. 이러한 항산화물을 키위, 양배추, 아몬드, 해바라기씨, 당근, 토마토와 같이 자연적인 방법으로 섭취하면 큰 효과가 있다. 이런 활성 산소 억제능을 측정하는 방법 중 하나가 DPPH법이다. DPPH는 C18H12O6이고 분자량은 394.32이다. 이 물질은 free radical(활성산소를 뜻함)로서 홑전자를 가지고 있어서 쉽게 반응을 한다. 그리고 이 물질은 농도에 따라서 용액의 색에 크게 영향을 미치는데 그 성질을 이용하여서 분광 광도계를 사용하여 DPPH가 반응이 일어남에 따라 파장이 흡수되는 정도의 차이를 측정하여 항산화 능력의 세기를 비교한다.
실험 방법
1. 실험 과정
1) DPPH 1mM stock solution을 에탄올로 희석하여 250μM 10㎖ DPPH solution을 만든다. (단, 라디칼은 빛과 온도 등 외부환경에 불안정하므로 반응 전까지 호일에 싸서 냉장고에 보관한다.
2) Standard인 20mM stock L-ascorbic acid를 물로 희석하여 200, 100, 50, 25, 12.5, 6.25μM 0.5㎖씩 E-tube에 만든다.
3) sample 또한 에탄올로 희석하여 200, 100, 50, 25, 12.5, 6.25μM 5구간의 농도 샘플을 0.5㎖씩 E-tube에 만든다.
4) 1)에서 만든 250μM DPPH solution을 0.5㎖씩 2), 3)에 각각 반응시킨다.
5) 암실에서 20min 반응시킨다.
6) UV spectrometer를 사용하여 517㎚에서 각각의 Abs.값을 측정한다.
7) 측정된 값을 가지고 라디칼 소거활성능을 계산한다.
8) 계산된 값으로 standard인 L-ascorbic acid와 비교한다.
[화공생물공학기초실험] 라디컬 소거활성 측정 - DPPH assay 레포트
1. 실험 목적 1.1. ROS pathway 및 radical에 의한 인체 내 산화적 스트레스에 대해 이해하고, radical 소거활성능 측정법 중 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH)법으로 항산화 활성을 측정한다. 1.2. 안정한 자유 라디칼인 2,2-diphenyl-1-picryl hydrazyl (DPPH)을 이용하여 일정량의 시료 용액과의 반응에 의하여 DPPH 라디칼이 감소하는 정도를 분광광도계로 측정하여 간접적으로
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