분자생물학실험 | 대장균의 형질전환

 

 

 

형질전환

Transformation(형질전환)이란 외부 DNA를 host cell(숙주 세포) 내에 넣어주어 세포가 원래의 성질과는 다른 새로운 유전형질을 추가로 얻게 되는 것이다. 모든 종의 세포에서 자연스럽게 일어나는 것이 아니고, DNA 흡수와 결합에 관련된 세포 표현 단백질인 수용성 요소를 가지고 있는 competent cell에서만 transformation 된다.

 

E. coil의 형질전환은 초기에는 발견이 되지 않았으나 bacteria를 차가운 CaCl₂로 처리한 다음 잠시 heat shock 하면 bacteriophage λ가 세포 내로 들어가 phage를 형성한다는 사실에 의해 처음 관찰되었다. 이와 같은 처리는 bacteria의 세포막이 DNA가 infection 될 수 있는 competent 상태로 일시적으로 유도되는 것으로 이때의 bacteria를 protoplast라고 한다. Pneumococcus에서 처음으로 발견된 이래 Streptococcus pneumoniase, Bacillus subtilis, B.stearothemophilus, Hasemophilus influenzae, Acinetobacter 등에서 널리 관찰되었습니다.

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실험 방법

1. 대장균 형질전환

1) -70℃ 냉동고에서 Competent cell을 꺼내어 얼음 위에서 천천히 녹인다.(5분)

 

2) 새 tube에 녹은 Competent cell 15㎕를 넣은 후, Plasmid DNA를 2㎕(농도:20ng/㎕) 넣고, 20분간 얼음에 꽂아 둔다.

 

3) 42℃에서 1분 40초 - 열충격(heat-shock)을 준다.

 

4) 다시 얼음에 꽂아 둔다.(10분)

 

5) LB액체 배지 200㎕ 첨가 후 Incubation 37℃ (40분)

 

6) 고체배지 (항생제배지)에 200㎕를 도말한다.

 

7) 37℃에서 12시간 이상 배양한다

 

8) 다음날 배지에 자라는 colony의 사진을 찍는다.

 

2. 플라스미드 DNA 분리 & DNA의 전기영동

1) TAE buffer 40㎖를 눈금실린더를 이용해 맞춘다.

 

2) Agarose를 buffer의 1%인 0.4g을 넣는다

 

3) 틀에 용액을 붓고, 굳을 때까지 기다린다.

 

4) 대장균이 배양된 배지를 750㎕를 micro tube에 옮긴다.

 

5) 13000rpm으로 1분간 돌린다.

 

6) 위에 상층액을 버린다.

 

7) 4), 5), 6)을 반복

 

8) 200마이크로피펫으로 상층액을 제거한다.

 

9) Sol I 250㎕을 넣는다. 5회 inverting한다.

 

10) Sol II 350㎕을 넣는다. 5회 inverting한다.

 

11) 13000rpm에서 10분간 원심 분리한다.

 

12) 상등액 850㎕을 spin column에 옮긴다.

 

13) 13000rpm에서 1분간 원심 분리한다.

 

14) wash buffer(Sol IV) 7550㎕을 넣는다.

 

15) 2분 후 13000rpm에서 1분간 원심 분리한다.

 

16) 하층액을 버리고 다시 13000rpm에서 1분간 원심 분리한다.

 

17) 하층액을 버리고 E.B용액을 넣는다

 

18) 13000rpm에서 5분간 원심 분리한다

 

19) 새 micro tube에 옮긴다.

 

20) loading dye 5㎕과 추출한 DNA 3㎕을 섞고 젤에 넣는다.

 

21) 전기영동장치의 플러그를 전력공급장치에 연결한 후, 전기를 걸어 20～30분간 전기영동을 한다.

 

 

 

[분자생물학실험]대장균의 형질전환 레포트