화공생물공학기초실험 | 박막크로마토그래피(Thin Layer Chromatography)

 

 

 

TIP

 

 

생물소재의 분리/정제 과정에서 얻어지는 혼합추출물에서 목적하는 물질을 신 속하고 간편하게 분리 동정하는 방법과 그 활용범위를 익힌다.

 

 

 

크로마토그래피는 2 종류 이상의 화학성분이 혼합되어 있는 생물소재 추출물이나 유기합성 과정에서 얻어진 화합물을 효과적으로 분리/정제 하는 방법이다. 물질이 분리되는 기본 원리는 정지상(stationary phase)가 이동상(moving phase)사이에서 각 물질이 가지는 독특한 용해도(solubility)와 흡착성(adsorption)의 차이에 따라 선별적으로 분배되는 성질을 이용하는 것이다.

 

박막크로마토그래피(TLC)는 정지상으로서 유리판이나 플라스틱판 위에 얇게(～0.25㎜) coating시킨 silica gel 또는 alumina 가 사용된다. TLC에서 주로 사용되는 실리카겔은 실리실산의 중합체로서 다공성의 입자를 형성하고 있으며 입자의 표면이 hydroxyl 기로 노출되어 극성을 띄고 있다.

 

Alumina도 aluminum hydroxide의 중합체로서 실리카겔과 유사한 물리적 성질을 가지고 있다. 이동상은 클로로포름, 에칠아세테이트, 메탄올 등 유기용매를 사용하며 실리카겔 또는 alumina 입자사이를 capillary action 에 따라 전개되는데, 이때 용매에 용해된 시료는 정지상과 이동상 사이의 분배계수에 따라 이동속도에 차이를 보이면서 분리 전개된다. 이때 작용하는 화학결합은 실리카겔의 하이드록실기와 시료 사이의 친수성 수소결합이다.

 

친수성 물질(극성물질)은 정지상인 실리카겔과의 결합력이 커서 늦게 이동하며, 소수성 물질(비극성물질)은 빠르게 전개딘다. 이동상 전개용매의 극성(polarity)을 조절함에 따라 물질의 전개 정도가 달라진다. 따라서 분리하고자 하는 물질의 성질과 종류마다 적합한 전개용 조건을 탐색하는 것이 중요하다. TLC 는 유기합성이나 유기물 추출 분리정제 과정에서 흔하게 사용되는 방법으로 물질의 동정, 순도확인 그리고 합성반응 또는 분리정제 과정을 모니터링 하는데 사용된다.

 

또한 분리정제과정의 최적화에 필요한 유기용매조건을 탐색하는 것에도 활용되며 신속하고, 적은 비용에 비하여 높은 민감도를 나타낸다. 최소 1ng까지 검출이 되며 통상적으로는 1～100ug의 샘플을 분석할 수 있다. 물질의 전개된 거리에 따라 (Retention factor) 값을 산출하는데 출발점으로부터 물질이 이동한 거리와 용매가 전개된 거리의 비율로 계산된다.

 

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실험 방법

1. TLC plate 및 전개용기 준비

① 준비된 TLC plate(각 조당 2장)에 연필을 사용하여(펜이나 볼펜 사용 금지!) 하단 1㎝ 위치를 가로질러 줄을 긋는다.

 

② 전개용기에는 전개용매(2종류)를 각각 바닥에서 1㎝를 넘지 않게 채우고 그림과 같이 Whatman filter paper를 적당히 잘라 용기 벽면에 위치하도록 세워두고 전개용기는 알루미늄 호일 등으로 밀폐시킨 후 약 30분간 방치한다.

 

2. TLC 용매의 준비

① 3:1:1(v/v/v）n-Butanol : Acetic acid : water 의 비로 50㎖을 혼합한다.

 

② 용매 조건에 따른 전개 정도를 관찰하기 위해 임의대로 혼합비율을 조성해본다.

 

3. 시료준비 및 Spotting

① 별도로 준비된 시료(지질의 혼합체)와 각각의 표준시료를 micro pipette을 사용하여 준비된 TLC plate의 하단에 그어진 연필선에 적당한 간격(～1㎝)으로 20～50㎕ 씩 spotting한다.

 

② 시료가 spotting된 TLC plate를 전개용기에 비스듬히 세워 위치시키고 다시 밀봉한다.(spotting 된 시료가 전개용매에 닿지 않도록 주의)

 

③ 전개용매가 TLC plate 상단 1～2㎝까지 이동할 때까지 전개시킨다.

 

④ 전개가 완료된 TLC plate를 꺼내서 전개용매의 경계를 표시하고 Fume hood에 놓여진 hot plate나 드라이기를 이용하여 건조시킨다.

 

4. 발색시약 분무 및 R_f값 측정

① TLC plate를 iodine vapor tank에서 최소 5min 동안 발색시킨 후 과도한 iodine은 hot plate위에서 날려버린다.

 

② 발색시약을 Neb㎕izer spray bottles(발색시약 미세분무 병)을 사용하여 TLC plate에 고르게 분무하여 발색 반응을 관찰한다.

 

③ 시료의 이동거리를 측정하여 기록하고 R_f값을 계산한다.

 

 

 

[화공생물공학기초실험]박막크로마토그래피(Thin Layer Chromatography) 레포트