생화학실험 | 대표적인 생화학 실험

 

 

 

TIP

 

 

1. 플라스미드 DNA를 통한 박테리아의 형질전환을 관찰한다.
2. selection marker의 원리를 이해하고, 박테리아를 selection한다.
3. PCR에 필요한 재료와 PCR의 원리를 이해하고, 플라스미드의 일부분을 증폭한다.
4. selection한 박테리아로부터 플라스미드를 추출하여 제한효소와 반응시킨다.
5. 제한효소와 반응시킨 플라스미드와 PCR로 증폭한 DNA를 λ/HindⅢ 마커와 같이 아가로오즈 겔로 전기영동을 하여 나오는 결과를 분석하고 이해한다.

 

 

 

pBluescript SK & GDA의 구성 및 특징

Plasmid DNA의 일종인 pBluescript Ⅱ SK(+)는 [그림 1]과 같이 구성이 되어있으며 형질 전환시 암피실린의 내성이 생기는 DNA가 selection marker로 쓰인다. 본 실험에서는 pBluescript plasmid와 여기에 GDA단백질을 첨가한 pBlue-GDA plasmid를 사용하는데 GDA DNA가 들어가는 위치는 pBluescript plasmid의 lac Z 의 사이, 더 정확히 말하면 T3, T7 primer binding site의 사이에 들어가게 된다.(사용된 제한효소는 EcoRⅠ이다) 따라서 두 플라스미드의 차이는 lac Z 유전자의 정상 발현 여부이며 이는 실험에서도 두 플라스미드에 의해 형질전환 된 박테리아를 배양함으로써 그 차이를 눈으로 확인해 볼 수 있다.

 

 

 

Restriction Enzyme(제한효소)

DNA의 특정한 염기배열을 식별하고 2중 나선을 절단하는 Endonuclease로서 유전공학에서 재조합 DNA를 만들기 위해서 사용하는 특수한 효소다. 이 실험에서 사용한 제한효소는 EcoRⅠ으로, pbluescript plasmid내에 GDA DNA 가 들어간 곳이 EcoRⅠ으로 잘리는 절단부위이다. 그러므로 pblue-GDA plasmid를 EcoRⅠ과 반응시기면 pbluescript와 GDA 두 가닥으로 분리가 된다.

 

 

실험 방법

실험 #1 : Plasmid를 이용한 박테리아의 형질변환 및 selection

1. Plasmid를 사용한 E.coli의 형질변환

① DH5α가 들어있는 tube(20㎕)에 4가지의 plasmid DNA 용액 2(ng)를 넣고 조심스럽게 저어 준 다음 얼음 속에서 10분간 보관한다.

② 42℃ water bath에 정확히 2분간 담그어 둔 다음 조심스럽게 얼음 위로 옮겨 5분간 방치한다.

③ SOC media 100㎕를 가하고 37℃ incubator에서 1시간 동안 배양한다.

④ LB-ampicillin agar plate에 1M IPTG 4..와 X-gal(20㎎/㎖) 40㎕를 떨어뜨리고 멸균한 spreader로 도말한다. 그 이후 30분정도 기다린다.

⑤ IPTG-X gal-ampicillin plate 위에 transformed bacteria를 적당량(50㎕) 떨어뜨리고 spreader를 이용하여 균일하게 퍼지도록 한다.

⑥ plate위의 media가 완전히 흡수되고 나면 37℃로 옮겨 배양한다.(14시간)

 

2. Selection된 Colony의 확인 및 inoculation(실험 2를 위한)

① spreading 했던 plate에 자란 콜로니를 관찰한다.

② LB/ampicilin broth(2㎖)이 들어있는 tube 8개를 준비한다.

③ Labeling을 한 뒤, 1～3번에는 파란색 콜로니를, 4～8번에는 흰색 콜로니를 분리하여 inoculation 한다.

 

실험 #2 : Agarose gel electrophoresis를 이용하여 박테리아 배양액으로 증폭한 Plasmid DNA와, 배양액에서 추출한 플라스미드를 제한효소와 반응시킨 DNA의 비교

1. 박테리아 배양액을 사용한 Plasmid DNA PCR

① 박테리아 배양액을 10배 희석한다.(DW180㎕+박테리아 배양액20㎕)

② 만들어져 있던 용액 10㎕에(PCR reaction buffer, dNTP, Taq DNA pol, DW) T3T7 primer 4㎕와 DW 4㎕를 혼합한다.

③ 10배 희석한 박테리아 배양액을 맨 마지막으로 2㎕씩 번호에 맞게 넣어준다.

 

2. plasmid DNA purification(using Gene-All plasmid kit)

① 박테리아 배양액을 1분간 12,000 rpm으로 원심분리한다.

② 상층액을 버리고, S1 buffer 250㎕에 다시 균일하게 퍼뜨린다. (vortex 가능)

③ S2 buffer 250㎕를 첨가하고, 5번 상하로 뒤집어서 섞어준 뒤 용액이 맑아질 때까지 기다린다. 단, 5분을 초과할 경우 다음 과정으로 진행한다.(vortex 불가)

④ S3 buffer 350㎕를 첨가하자마자 4～6번 상하로 뒤집어서 섞어준 뒤 10분간 원심분리한다.

⑤ ④에서 원심분리한 결과물 중 상층액을 spin column으로 옮긴다. 그 뒤 30초간 원심분리를 하고 통과한 용액을 버린다.

⑥ PW buffer 700㎕를 추가하여 30초동안 원심분리를 하고 통과한 용액을 버린다.

⑦ 그 후 1～2분 정도 centrifuge(12000rpm)를 해주고 1.5㎖ tube 에 spin column을 옮긴다.

⑧ Elusion buffer 50㎕를 추가하고 1분뒤에 2분동안 원심분리한다.

⑨ Eluted plasmid DNA를 모아서 라벨링한다.

 

3. Restriction Endonuclease Digestion

① EcoRⅠ digestion solution 18㎕에 추출한 plasmid DNA 2㎕를 섞어준 뒤 37℃ incubator에서 1시간 반응시킨다.

 

4. Agarose Gel Electrophoresis

① Agarose gel의 well에 다음과 같이 시료를 로딩한다.

lane 1 : λ/HindⅢ marker(5㎕, 250ng)

lane 2～9 : PCR product 20㎕ + 6x gel loading buffer 섞은 후 10㎕

lane 10～17 : 제한효소 반응까지 마친 플라스미드 20㎕ + 6x gel loading buffer 섞은 후 10㎕

 

② 50～100V의 전압을 걸어주고 BPB dye가 gel의 2/3 부분에 도달할 때까지 전기 영동한다.

③ 전기영동이 끝나면 UV illuminator로 비추어 결과를 관찰하고 폴라로이드 카메라를 사용하여 사진을 찍는다.

 

 

 

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